Manutenção e avaliação de vários tipos de tecidos e células do olho usando um novo sistema fluídico sem bomba

Summary

A análise em tempo real de tecidos vivos fornece dados funcionais e mecanísticos importantes. Este artigo descreve os protocolos e variáveis críticas para garantir a geração precisa e reprodutível de dados por um novo sistema fluídico multicanal livre de bombas que mantém e avalia uma ampla gama de modelos de tecidos e células.

Abstract

Muitos modelos in vitro usados para investigar a função tecidual e a biologia celular requerem um fluxo de meios para fornecer oxigenação adequada e condições celulares ótimas necessárias para a manutenção da função e viabilidade. Para este fim, desenvolvemos um sistema de cultura de fluxo multicanal para manter tecidos e células em cultura e avaliar continuamente a função e viabilidade por sensores em linha e/ou coleta de frações de escoamento. O sistema combina detecção óptica contínua de 8 canais da taxa de consumo de oxigênio com um coletor de fração integrado para medir simultaneamente as taxas de produção de metabólitos e secreção de hormônios. Embora seja capaz de manter e avaliar uma ampla gama de modelos de tecidos e células, incluindo ilhotas, músculo e hipotálamo, aqui descrevemos seus princípios operacionais e as preparações/protocolos experimentais que usamos para investigar a regulação bioenergética da retina isolada de camundongos, epitélio pigmentado da retina de camundongos (EPR)-esclera coroide e células de EPR humanas cultivadas. Inovações no projeto do sistema, como o fluxo de fluido sem bomba, produziram uma operação muito simplificada de um sistema de fluxo multicanal. São mostrados vídeos e imagens que ilustram como montar, preparar o instrumento para um experimento e carregar os diferentes modelos tecido/célula nas câmaras de perifusão. Além disso, diretrizes para a seleção de condições para experimentos específicos de protocolos e tecidos são delineadas e discutidas, incluindo o estabelecimento da relação correta entre fluxo e tecido para obter condições de cultura consistentes e estáveis e determinações precisas das taxas de consumo e produção. A combinação de manutenção tecidual ideal e avaliação em tempo real de múltiplos parâmetros produz conjuntos de dados altamente informativos que terão grande utilidade para a pesquisa na fisiologia do olho e descoberta de drogas para o tratamento da visão prejudicada.

Introduction

Os sistemas de perifusão têm uma longa história nas ciências da vida. Em particular, para o estudo da função secretora pelas ilhotas, elas têm sido utilizadas para caracterizar a cinética de secreção de insulina em resposta aos secretagogos¹. Além da coleta das frações de escoamento para posterior dosagem de hormônios e metabólitos, sensores em tempo real têm sido incorporados, predominantemente para a detecção do consumo de oxigênio ^2,3,4. Esforços difundidos para melhor compreender os mecanismos mediadores de doenças do olho têm sido limitados pela falta de métodos fisiologicamente relevantes para avaliar a regulação metabólica e a desregulação dos vários componentes isolados do olho, incluindo a retina, o epitélio pigmentado da retina (EPR)-coróide-esclera e as células do EPR cultivadas. Sistemas estáticos projetados para células cultivadas foram adaptados para o tecido⁵, mas o tecido requer fluxo para oxigenação adequada. Os sistemas de fluxo têm sido bem-sucedidos em medir com precisão e reprodutibilidade as respostas em tempo real na taxa de consumo de oxigênio (OCR) pela retina e PSE-coróide-esclera, e os tecidos permanecem metabolicamente estáveis por mais de 8 h, permitindo protocolos altamente informativos envolvendo múltiplos compostos de teste 4,6,7,8,9 . No entanto, a operação de sistemas fluídicos tem historicamente exigido um aparato sob medida e pessoal técnico treinado em metodologias não padronizadas. Tais sistemas não têm sido adotados como metodologia padrão na maioria dos laboratórios. O BaroFuse é um sistema fluídico recém-desenvolvido que não depende de bombas, mas sim da pressão do gás para conduzir o fluxo através de múltiplos canais e câmaras de tecido (Figura 1). Cada canal é continuamente monitorado para OCR, e o fluxo de saída é coletado com um coletor de fração baseado em placa para posterior ensaio de conteúdo. É importante ressaltar que as câmaras de perifusão de tecido para o instrumento são projetadas para acomodar tecidos de várias geometrias e tamanhos.

O coração do instrumento é o sistema fluídico, onde o fluxo é conduzido de um reservatório selado e pressurizado através de tubos de pequeno diâmetro interno (ID) (contribuindo com a resistência ao fluxo mais significativa no circuito do fluido) até as câmaras de tecido de vidro que abrigam o tecido. A pressão para o módulo reservatório do meio (MRM) é fornecida por reguladores de baixa e alta pressão conectados a um cilindro de gás contendo uma mistura de gases (tipicamente 21% O 2, 5% CO 2, balanço N₂), e o reservatório é selado a partir do topo pelo módulo da câmara de perifusão (PCM) que contém os conjuntos da câmara de tecido (TCAs). A vazão é controlada pelo comprimento e ID dos tubos de resistência e pelo ajuste de pressão de um regulador de baixa pressão. Os tubos de saída conectados ao topo das câmaras de tecido fornecem fluido para um recipiente de resíduos (que é continuamente pesado para determinação automática da taxa de fluxo) ou para poços de uma placa de 96 poços controlada pelo coletor de fração. O sistema de detecção O 2 mede a vida útil de um corante sensível ao O₂ pintado no interior de cada uma das câmaras de tecido de vidro a jusante do tecido. Essas informações são usadas para calcular continuamente o OCR. Todo o sistema fluídico reside em um gabinete com temperatura controlada e o tanque de gás, o coletor de frações e o computador são os principais componentes do instrumento (Figura 2A). Finalmente, o software que executa o instrumento serve para controlar sua operação (incluindo a preparação e o tempo de compostos de teste injetados, o sistema de medição de vazão e o tempo do coletor de fração), bem como processar e representar graficamente os dados de OCR e outras medições suplementares.

Neste trabalho descrevemos os protocolos de utilização do sistema fluídico para perifundir e avaliar OCR e taxa de produção de lactato (RLF) para vários componentes isolados do olho. O RLF é um parâmetro que reflete a taxa glicolítica altamente complementar ao OCR, onde o par responde pelos dois principais ramos de geração de energia a partir de carboidratos na célula¹⁰. Como a preparação do tecido e o carregamento nas câmaras de tecido é melhor aprendido assistindo ao procedimento, o vídeo ajudará a ilustrar várias das etapas críticas que são realizadas durante a configuração e operação que não são facilmente transmitidas apenas pelo texto.

A descrição do protocolo é dividida em 8 seções que correspondem a diferentes fases do experimento (Figura 2B): 1. preparação pré-experimental; 2. preparação/equilíbrio do perifusato; 3. criação de instrumento; 4. equilíbrio tecidual; 5. protocolo experimental; 6. quebra de instrumento; 7. tratamento de dados; e 8º. ensaios de frações de escoamento.

Protocol

Todos os procedimentos para a coleta de tecidos de ratos e camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Washington.

1. Preparação pré-experimental

Observação : as tarefas a seguir são concluídas pelo menos um dia antes do experimento.

1. Delineamento do protocolo experimental
   1. Atribuição da colocação do tecido nos canais: Escolha o modelo de tecido ou célula a ser colocado em 3 dos 4 canais de cada lado da MRM. Uma câmara de tecido de cada lado é executada sem tecido para ser usado para correção basal.
   2. Organizar as amostras usando um dos dois modelos típicos - diferentes protocolos de compostos de teste em cada lado (por exemplo, canais de um lado do MRM recebem compostos de teste enquanto os canais do outro lado atuam como um controle); mesmo protocolo de injeção de composto de teste em ambos os lados da MRM, mas diferentes tecidos ou modelo de tecido versus controle em ambos os lados da MRM.
   3. Seleção da taxa de fluxo e quantidade de tecido para a medição ideal de OCR: Ajuste a taxa de fluxo até que a mudança na razão de vida útil vezes 100 seja de aproximadamente 3.
      NOTA: As quantidades típicas de tecido e as taxas de fluxo correspondentes são mostradas na Tabela 1 para os componentes do olho, onde o instrumento funciona melhor em taxas de fluxo entre 6-80 μL/min/canal.
   4. Cálculo do volume de mídia/buffer necessário: Calcule o volume de mídia a ser adicionado a cada inserção de MRM no início do experimento como
      Volume_MRM = 30 mL + Duração do Protocolo (em min) x Vazão (em mL/min) x 4 canais (Eq.1)
      Por exemplo, a 0,01 mL/min, um volume MRM inicial de 60 mL permitirá um protocolo de 12,5 h (onde 30 mL serão esgotados, enquanto 30 mL serão restantes), enquanto que em 0,04 mL/min, 90 mL de volume_MRM inicial permitirá um protocolo de 6 h (com 30 mL restantes).
   5. Protocolo de injeção de compostos de teste: Selecione os compostos de teste a serem avaliados, a concentração a ser testada (normalmente escolhida para produzir resposta próxima da máxima ou como dependências de concentração) e a duração da exposição. Considere a solubilidade e componha os estoques no solvente desejado, como água, DMSO ou etanol.
   6. Selecione o tempo das injeções e injeções subsequentes para que a resposta atinja um estado estacionário antes de adicionar um agente subsequente. Ao repetir protocolos, combine o tempo das injeções para que vários cursos de tempo possam ser medidos.
      NOTA: Os compostos usados aqui são de um teste de estresse mitocondrial (Mito) anterior ¹¹ e tanto a oligomicina quanto o cianeto de carbonila 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP) requerem DMSO tanto nas soluções estoque, quanto no perifusato final.
   7. Tempos de amostragem de vazão: Selecione os intervalos de coleta de fração desejados (de 1-60 min/amostra), onde taxas de amostragem mais rápidas são escolhidas para mudanças rápidas, e intervalos de tempo mais longos são escolhidos à medida que o estado estacionário é abordado. Utilizar volumes de poço adequados (0,3 a 1,5 mL) para evitar transbordamento durante o intervalo de amostragem (escolha volumes maiores que a vazão x intervalo de tempo).
      NOTA: Os tempos de amostragem variam de acordo com a escolha do protocolo, mas para um teste de esforço de Mito, temos comumente usado intervalos de 5 min durante a linha de base e intervalos de 15 min durante as injeções (-15, -10, -5, 0, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 105, onde cada vez é o início do intervalo de amostragem).
   8. Insira os valores selecionados para compostos de teste e coleta de frações descritos acima na interface do usuário (UI), que gera representações gráficas dessas informações. Exportar e divulgar arquivos para avaliação e discussões em grupo (Figura Suplementar 1).
2. Defina os acessórios e peças consumíveis
   1. Definir os suprimentos fornecidos e pré-embalados assepticamente pelo fabricante, que incluem: TCAs (pacote de 8), conjuntos de tubos de saída (pacote de 8 tubos), tubos de injeção de compostos de teste (2), pinças, abraçadeiras de tubos (3), MRM, insertos MRM (2), barras de agitação (2) e conjunto de tubos de purga (colocados em um gabinete de segurança biológica).
   2. Não reutilize peças descartáveis que entrem em contato com líquido, pois isso levará a um aumento de falhas experimentais. Reutilize as pinças e agite as barras limpando-as e autoclavando-as entre os experimentos.

2. Preparação e equilíbrio do perifusato (Tempo: 30 min sem incluir o tempo de incubação)

1. Preparar o meio ou tampão de bicarbonato Krebs-Ringer (KRB) no dia anterior com base nos cálculos da equação 1, tipicamente 200 mL, e incubar durante a noite em uma incubadora de 39 °C/5% CO₂ em frascos de cultura de tecidos T225 com no máximo 90 mL em cada frasco.
2. Se utilizar KRB ou meios preparados comercialmente (aquecidos à temperatura ambiente), prepare o perifusato na manhã do experimento e coloque na incubadora de CO₂ a 5% por pelo menos 1 h. Preparar todas as soluções de forma asséptica.
   NOTA: Todos os líquidos e partes do sistema fluídico que entram em contato com o líquido são estéreis no início do experimento. No entanto, a montagem do sistema e o carregamento do tecido são realizados abertos ao ar.

3. Equilíbrio de temperatura e gás dissolvido para montagem do instrumento (Tempo: 75 min)

1. Fixação de conjuntos de tubulação ao MRM
   1. Coloque o MRM e um pacote fluídico na bancada ao lado do instrumento. Certifique-se de que as abraçadeiras tubulares (3), barras de agitação (2) e pinças já estejam na bandeja de ferramentas.
   2. Coloque uma pastilha MRM não utilizada com uma barra de agitação em cada lado da MRM (ver Figura 3).
   3. Conecte os TCAs às portas de injeção em ambas as extremidades do MRM para que a extremidade da tubulação seja posicionada diretamente sobre a barra de agitação. Certifique-se de que o mais longo dos dois conjuntos de injeção de composto de teste esteja na parte traseira do MRM.
   4. Em seguida, conecte a linha de alimentação de entrada de gás e o conjunto de tubos de purga às portas vazias traseira e dianteira, respectivamente (consulte a Figura 4A).
2. Colocação dos conjuntos MRM/tubulação no gabinete
   1. Coloque o MRM (com os conjuntos de tubulação conectados) no aquecedor MRM (Figura 4B).
   2. Posicione os quatro conjuntos de tubos nos sulcos das paredes na base do compartimento (dois de cada lado) de modo que eles se projetem para o exterior do compartimento assim que o compartimento do meio for colocado no lugar.
   3. Fixe o MRM entre as braçadeiras apertando as duas rodas no suporte do detector.
   4. Alimente o conjunto de injeção de composto de ensaio mais longo que se projeta da parte de trás do compartimento através das duas guias de tubo na lateral do compartimento de modo que a abertura dos tubos fique voltada para frente (Figura 4C).
   5. Aperte cada um dos conjuntos de injeção de compostos de teste fechados.
3. Montagem do gabinete e ativação dos controladores de temperatura
   1. Alterne a faixa de energia que fornece energia para todos os dispositivos elétricos dentro do gabinete para a posição ON. O ventilador no suporte do detector ligará e o controlador de temperatura MRM acenderá exibindo um valor definido de 38 °C (Figura 5).
   2. Ligue os agitadores a 70 rpm usando a interface do usuário para garantir que as barras de agitação estejam girando suavemente. Uma vez observada a agitação adequada, desligue os agitadores.
   3. Coloque a seção do meio do compartimento em cima da base.
   4. Conecte o cabo na seção central do gabinete ao cabo da caixa elétrica para conectar a energia ao interruptor da alavanca do controlador de temperatura ambiente e fornecer energia ao aquecedor de temperatura ambiente.
   5. Coloque a tampa no compartimento e o visor do controlador de temperatura superior (o controlador de temperatura ambiente) acenderá e lerá 36 °C. Inicie um temporizador por 30 min, o tempo necessário para que o aquecedor MRM atinja a temperatura do ponto definido.
4. Inserindo os TCAs no PCM
   1. Use a ferramenta de inserção de TCA para inserir cada um dos 8 TCAs nos orifícios do PCM, pressionando firmemente o adaptador com a face da ferramenta de inserção até que a parte superior da manga do tubo enrolada ao redor da câmara de tecido toque a superfície circunscrevendo os orifícios no PCM.
   2. Insira completamente um TCA antes de inserir o próximo. Coloque o PCM parcialmente montado ao lado da cinta PCM e 6 parafusos.
      NOTA: A inserção incompleta de um TCA impedirá que o espaço da cabeça atinja o ponto de ajuste de pressão e o perifusato não fluirá.
5. Preenchimento das duas pastilhas na MRM com perifusato pré-equilibrado
   1. Para fazer isso, 30 min após a montagem do compartimento e o MRM ter atingido a temperatura, transfira o perifusato pré-equilibrado para a pastilha de MRM pré-aquecida, distribuindo suavemente o líquido pelas laterais usando uma pipeta de 50 mL.
      NOTA: Estas etapas, bem como as do ponto 3.6, devem ser realizadas imediatamente para evitar a transferência de gás entre o perifusato no MRM e a atmosfera.
6. Montagem do MRM/PCM para criar uma vedação estanque ao gás e posicionamento do detector O₂
   1. Coloque o PCM no MRM inserindo os tubos de resistência dos TCAs que emanam do fundo do PCM nas inserções do MRM, 4 de cada lado do Divisor MRM. Orientar a PCM para que as câmaras de tecido possam repousar contra o detector de O₂ uma vez posicionado.
   2. Fixe o PCM e a cinta de suporte PCM com os 6 parafusos usando a chave de fenda elétrica.
   3. Fixe os ADTs dentro das aletas de suporte do PCM com o elástico fornecido esticando-o ao redor das aletas do PCM ao nível das juntas de borracha (Figura 6).
   4. Posicione o detector O₂ no suporte do detector de modo que a face dele fique encostada nas aletas do PCM. Verifique se os pares LED/fotodetector se alinham com o corante sensível ao O₂ nas câmaras de tecido. Se necessário, ajuste as guias laterais do detector_Ø 2 depois de soltar os parafusos ajustados na lateral do suporte do detector_{Ø 2} .
   5. Coloque a tampa em cima do compartimento.
7. Equilibrando o gás no espaço cefálico na MRM com o perifusato
   1. Com a válvula de alta pressão totalmente presa e fechada, abra a válvula do tanque de gás girando a válvula do cilindro em cima do tanque no sentido anti-horário.
   2. Ajuste o regulador de alta pressão para uma pressão de 10 psi usando o botão do regulador.
   3. Pressurizar o MRM ajustando o regulador de baixa pressão para 1,0 psi (Figura 7A).
   4. Desaperte o tubo de purga (Figura 7B) para permitir que o gás do tanque substitua o ar no headspace MRM (os injetores compostos de teste permanecem presos) por 15 min. Confirme o fluxo de gás submergindo a extremidade do tubo de purga em um copo de água para observar o borbulhamento.
   5. Uma vez confirmado o fluxo, inicie o detector de O₂ conforme descrito abaixo no ponto 3.8.
   6. Após 15 min, ligue o agitador a 70 rpm e deixe funcionando pelo restante do experimento. Após mais 15 min, prenda o conjunto da tubulação de purga (Figura 7C).
   7. Diminua a pressão no regulador de baixa pressão para a pressão de operação que atinge a vazão de líquido desejada (conforme especificado pelo pacote experimental - geralmente entre cerca de 0,5-0,7 psi). Se o fluxo estiver acima de 20 μL/min, ajuste temporariamente a pressão para 0,3 psi para dar tempo de carregar o tecido sem que as câmaras transbordem. Isso não é necessário se o tecido for carregado dentro de 15 minutos após a pinça ser colocada.
      NOTA: Não deixe o tampão escorrer pela parte externa da câmara de tecido, pois o fluido pode interferir na detecção de O₂ .
8. Iniciando o detector O₂
   1. Ative o software do detector O₂ no laptop clicando no ícone chamado Detector de oxigênio.
   2. Quando o programa for aberto (Figura 2 Suplementar), confirme se a porta COM correta está selecionada. Se necessário, a porta COM pode ser identificada desconectando e conectando o detector O₂ do computador para que o número da porta seja exibido. Se a porta COM for desconectada enquanto o aplicativo estiver em execução, o aplicativo deverá ser fechado e reaberto antes do uso.
   3. Clique em Iniciar e em Gravar (e salve os dados na pasta de backup). Em seguida, clique em Gráfico.
   4. Altere o valor médio na parte inferior esquerda do gráfico de vida útil para 5 (que instrui o programa a calcular uma média móvel com 5 pontos consecutivos). Depois de passar um minuto e o primeiro ponto de dados ser exibido na tela de gráfico, clique em Dimensionamento automático.

4. Carga tecidual e período de equilíbrio (Tempo: 90 min)

1. Posicionamento das frits nas câmaras de tecido
   1. Remova a tampa e as seções do meio do compartimento.
   2. Depois que o perifusato nas câmaras de tecido tiver subido acima do topo da frita pré-posicionada, empurre a frita para baixo com o sinal da frita, batendo levemente no topo da frita para remover quaisquer bolhas de ar que se formaram abaixo ou dentro da frita.
   3. Posicione as frits cerca de 0,25 polegada acima do fundo da câmara de tecido.
2. Carregando tecido nas câmaras de tecido
   1. Uma vez que o nível de mídia é de 0,5 polegada do topo, carregue o tecido na câmara.
   2. Retina de carga ou EPR-coroide-esclera: Retina de colheita ou EPR-coroide-esclera conforme descrito em ⁶. Para carregar o tecido, use pinças de ponta fina para colocar suavemente o tecido em cada câmara, tomando cuidado para não dobrar o tecido, enquanto usa um lenço de tecido para evitar que o líquido da câmara de tecido escorra para o sensor O₂ . Observe o tecido afundando em direção e sobre a frita.
      NOTA: Entre o momento da colheita do tecido e a carga do tecido nas câmaras, certifique-se de que o trauma no tecido seja evitado, não deixando o tecido em um tampão/meio à base de bicarbonato fora da incubadora por mais de 10 minutos e garantindo que o tecido seja banhado em tampão/meio suficiente (pelo menos 1 mL/10 mg de tecido) para evitar que o tecido se torne hipóxico e evite a exposição ao ar.
   3. Carregando células de EPR em membranas de transbem: Prepare células de EPR conforme descrito anteriormente ¹² e no Arquivo Suplementar 1. Células de passagem utilizando tripsina-EDTA a 0,25% e sementes em polietileno tereftalato, filtros condicionados por esteiras (insertos de cultura celular, tamanho de poro 0,4 mm) a um mínimo de 2,0 x 10⁵ células/^cm2. No dia do experimento, cortar as membranas em três tiras de igual largura e carregar com pinça nas câmaras de tecido (ver Figura 8A).
3. Anexando os conjuntos de tubos de saída às câmaras de tecido
   1. Remova os conjuntos de tubos de saída da embalagem e coloque o separador de tubulação de saída no lábio da seção central do gabinete para que os adaptadores de tubulação de saída fiquem no interior do gabinete (Figura 8B,C).
   2. Tomando cuidado para não forçar demais os TCAs (ou eles se soltarão do MRM), conecte os adaptadores de tubulação de saída na parte superior dos TCAs das câmaras de tecido (Figura 8D). Substitua o meio do gabinete e reconecte o cabo de controle de temperatura ambiente.
   3. Antes de substituir a tampa do gabinete, confirme se os componentes do sistema fluídico dentro do gabinete, incluindo o detector O₂ , PCM, câmaras de tecido, tubos de saída, MRM e aquecedor, estão todos posicionados corretamente, como mostrado na Figura 8E.
   4. Substitua a tampa do compartimento. Alimente os oito tubos de saída através do braço guia coletor de frações.
4. Ativando o coletor de frações
   1. Certifique-se de que o coletor de frações esteja centralizado em relação à parede direita do compartimento e ao suporte do tubo de saída: o suporte esquerdo da base do coletor de frações deve repousar contra a borda da parede do compartimento.
   2. No laptop, clique no atalho da interface do usuário e a página de informações experimentais será aberta (Figura 3 Superior ).
   3. Preencha as informações nas caixas apropriadas na página de informações experimentais (isso pode ser feito antes do início do experimento) e, em seguida, clique na página Flow & Fraction Collector na parte superior (Figura Suplementar 3 Abaixo).
5. Definindo parâmetros para medição automatizada de vazão
   1. Selecione o tempo de integração desejado no menu suspenso Tempo de aquisição da amostra no meio superior que equilibra a precisão desejada (que é proporcional ao tempo de integração) e a resolução temporal.
   2. Se nenhuma fração de saída for coletada no experimento, clique em Iniciar e vá para a seção 4.7. Se as fracções de escoamento forem recolhidas, execute as etapas do ponto 4.6.
6. Coleta de frações de escoamento
   1. No software da interface do usuário, verifique a opção Coletar frações? na página de informações do experimento ou na página do coletor de fração de fluxo e pêncio. Em seguida, clique no botão Compute FC Settings (Configurações de FC de computação).
   2. Quando a nova janela se abrir, preencha o tempo da primeira injeção no protocolo (definido como tempo = 0) e a vazão por canal, bem como os intervalos de tempo para cada amostra. Em seguida, clique em Computar.
   3. Verificados os intervalos da coleta, clique em Gerar e Iniciar.
7. Medição de vazões para canais individuais (Opcional)
   1. Se as taxas de fluxo de canais individuais devem ser medidas (que em condições normais variam apenas alguns por cento), pesar oito (ou menos) tubos de microcentrífuga e registrar seu peso.
   2. Ajuste o suporte do tubo que contém os tubos de microcentrífuga pré-pesados no carro da placa. Clique em Medir Vazão Manualmente na seção outros utilitários.
   3. Selecione a duração da medição e clique em Gerar modelo. Feche a janela e clique em Iniciar. O coletor de fração coletará o fluido dos tubos de saída durante a duração da medição e, em seguida, o braço retornará à sua posição inicial.
   4. Pesar os tubos de microfuga após a recolha e utilizar a diferença de peso dividida pela duração da medição para calcular o caudal (em que 1 mg = 1 μL).
8. Estabilização basal
   1. Uma vez que o tecido e/ou as células tenham sido carregados nas câmaras teciduais, deixe o sistema se equilibrar por 90 min para estabelecer uma linha de base plana de consumo de O₂ , momento em que o primeiro composto de teste pode ser injetado (considerado tempo = 0).
   2. Aos 30 minutos antes da primeira injeção, insira o valor médio dos últimos 3 FR por canal na página de injeção para preparar injeções de composto de teste.

5. Protocolo experimental (Tempo: 2-6 h)

NOTA: Uma vez que a estabilização da linha de base esteja em andamento, as próximas tarefas são injetar os compostos de teste e trocar as placas no coletor de fração, se mais de uma for usada.

1. Preparação do composto de ensaio injectado
   1. Insira os nomes dos compostos, as concentrações desejadas (soluções finais e estoque) e os tempos de injeção dos compostos de teste na tabela na interface do usuário na página Injeção. Confirme as informações exibidas no programa, incluindo os volumes no MRM deixados no momento das injeções e a quantidade de solução estoque a ser injetada para atingir as concentrações desejadas (Figura 4 suplementar).
   2. Para calcular a quantidade de perifusato e estoque necessários para a injeção, preencha as caixas brancas da tabela de injeção e clique em Computar. Utilizando os valores calculados, diluir a solução-mãe do composto de ensaio com perifusato antes da injeção, de modo a que o volume injectado seja de 5% do volume na MRM após a injeção.
   3. Preparar cada composto de ensaio misturando a solução-mãe e o perifusato. Carregar as seringas durante, pelo menos, 10 minutos antes da hora de injeção e manter numa incubadora de CO₂ (mantida a temperaturas entre 37-40 °C) até estar pronta a injetar.
2. Injeção de compostos de teste
   1. Ligar a seringa que contém o composto de ensaio às linhas de injeção (figura 9A). Desapertar o tubo de parede macia que conduz à linha de injeção e injetar lentamente os compostos de teste (Figura 9B) a uma taxa de aproximadamente 3 mL/min. Aperte novamente a tubulação na linha de injeção e, em seguida, retire a seringa (Figura 9C); repetir para o outro lado da MRM.
   2. Depois de injetar cada composto de teste, prepare cada composto de teste subsequente para ser injetado de acordo com a página de injeção UI.
3. Determinação do sinal de entrada O₂ para cada canal
   1. No final de cada experimento, injetar o inibidor respiratório KCN (3 mM) para determinar o sinal de vida útil do influxo para cada canal, que é usado para corrigir a variação na vida útil do sensor basal e no consumo não mitocondrial de oxigênio.

6. Finalização do experimento e quebra do sistema (Tempo: 30 min)

1. Economizando dados de oxigênio
   1. Clique no botão Salvar no canto superior esquerdo da janela gráfica no software do detector de oxigênio; Nomeie o arquivo e armazene-o na pasta onde o arquivo será mantido. Clique no botão Parar gravação na janela principal para salvar o arquivo de backup.
2. Salvando o arquivo de informações experimentais da interface do usuário
   1. Clique no botão Salvar perfil no canto superior esquerdo da página geral da interface do usuário; Nomeie o arquivo e armazene-o na pasta onde o arquivo será mantido. Na página de fluxo de fração & da interface do usuário, clique no menu suspenso Ferramentas e em Salvar. Mantenha o nome gerado ou escolha outro e armazene o arquivo onde desejar. Se necessário, existem arquivos de backup que podem ser acessados e salvos.
3. Decomposição do instrumento
   1. Como o KCN é volátil, descarte conjuntos fluídicos em uma capela de fumaça; despeje a mídia da bandeja de resíduos MRM e FC em um recipiente de resíduos e enxágue as pastilhas MRM e agite as barras completamente com água. Deite o conteúdo do contentor de resíduos (contendo KCN) num contentor de resíduos químicos rotulado para posterior eliminação por segurança química. Antes do próximo experimento, limpe e autoclave completamente as barras de agitação e pinças.

7. Processamento de dados (Tempo: 15-45 min)

1. Abra o aplicativo processador de dados em um computador Mac ou PC. Selecione o arquivo de dados .csv gerado por um experimento. Se o protocolo deste experimento for semelhante a um experimento analisado anteriormente, selecione esse arquivo de configurações e clique em Próxima etapa. Caso contrário, basta clicar em Próximo Passo para começar a inserir as configurações do experimento.
2. Preencha as várias configurações do experimento. Na determinação do ponto de tempo de referência, selecione o ponto de tempo diretamente antes da KCN entrar em vigor e os valores de Lifetime diminuírem. Selecione esse ponto com o uso de um controle deslizante ou digitando o valor de tempo na caixa.
3. Clique em Calcular para gerar gráficos OCR de acordo com a equação 2:
   OCR = ([O 2]_in- [O 2]out) x FR = (217 nmol/mL - [O 2]_out) x FR/base tecidual (Eq. ₂)
   onde A concentração de O 2 em KRB quando em equilíbrio com 21% de O₂ a 37 °C é de 217 nmol/mL, FR é a taxa de fluxo (em mL/min), base tecidual é a quantidade de tecido carregado na câmara (ou seja, número de retinas, células RPE-coróide-esclera ou EPR).
4. Salve os gráficos como arquivos .pdf pressionando o botão Exportar gráfico . Gráfico OCR como valores absolutos ou como uma fração de um valor de estado estacionário marcando as caixas que correspondem ao composto de teste a ser definido como 1 na página de configurações de edição.

8. Ensaios de frações de escoamento

1. Se as amostras não puderem ser ensaiadas imediatamente após a experiência, colocar as placas a 4 °C, se ensaiadas no dia seguinte, ou congeladas, se armazenadas por mais tempo. Se as placas estiverem congeladas, descongele as amostras a 4 °C (para que as amostras permaneçam frias).
2. Uma vez que os ensaios são realizados nas frações de escoamento selecionadas, as colunas de dados (uma por canal) são inseridas em um arquivo .csv com tempo (em min) na coluna mais à esquerda e concentração na direita (em nmol/mL ou ng/mL); Um link no programa de processamento de dados quando pressionado carrega um modelo.
3. Carregue esse arquivo no processador de dados para calcular e plotar os dados.

Discussion

Devido à importância da bioenergética em todos os aspectos da função celular e manutenção de vários componentes do olho, há uma necessidade crítica de métodos para estudar sua regulação. Em particular, a retina neural e o EPR dependem do metabolismo tanto para a geração de energia quanto para a sinalização intra e intercelular^14,15,16,17. Devido à sua alta capacidade oxidativa, os tecidos isolados do olho não são bem mantidos em condições estáticas^18,19 e^, portanto, o estudo de componentes isolados do olho requer sistemas de fluxo que possam manter e avaliar processos metabólicos. O sistema fluídico foi desenvolvido para gerar dados de OCR e LPR de uma ampla gama de tipos de tecidos e neste trabalho apresentamos protocolos detalhados que produziram ótimos resultados.

O principal determinante para a geração de dados robustos usando o sistema de fluxo inclui o pré-equilíbrio do meio/tampão à base de CO₂ a 39 °C (para garantir que o perifusato não seja supersaturado com gás dissolvido que desgaseificado durante o experimento). Em particular, o meio ou tampão KRB armazenado a 4 °C será supersaturado em relação a 37 °C e desgaseificado durante o experimento se os tempos de pré-equilíbrio forem insuficientes. Além disso, o tecido carregado nas câmaras teciduais não deve ser traumatizado pelo isolamento inadequado do tecido devido ao rasgo ou separação incompleta do tecido, ou pela exposição do tecido em baixa quantidade de tampão à base de bicarbonato ao ar atmosférico por muito tempo. O controle de temperatura, a estabilidade do fluxo e a confiabilidade da detecção de O₂ têm pouca variabilidade e esses fatores não contribuem significativamente para a taxa de falha.

O instrumento possui oito canais de fluxo/câmaras teciduais que funcionam simultaneamente e que são abastecidos com perifusato de dois reservatórios, quatro câmaras de tecido para cada reservatório. Para obter os cursos de tempo mais precisos do OCR, as curvas cinéticas são corrigidas na linha de base por câmaras que não são carregadas com tecido. Assim, um protocolo experimental típico envolveria dois grupos de três câmaras teciduais. Os protocolos em geral se enquadram em duas categorias: uma são os diferentes protocolos de compostos de teste de cada lado (por exemplo, droga/veículo de um lado do MRM e apenas veículo do outro); o segundo é o mesmo protocolo de injeção de composto de teste em ambos os lados da MRM, mas diferentes modelos de tecido ou tecido em cada lado da MRM. Neste trabalho, os efeitos da oligomicina e do FCCP na retina foram comparados com OCR por tecidos que não foram expostos a nenhum composto teste, e dois tecidos foram avaliados concomitantemente sob o mesmo protocolo e condições para identificar o comportamento tecido-específico. Este último foi ilustrado neste estudo mostrando aumento da faixa dinâmica da taxa metabólica por PSE-coróide-esclera em relação à retina em paralelo no mesmo experimento. Outros relatos descreveram uma gama mais ampla de desenhos de estudo, incluindo a medição dos efeitos variando os níveis de O₂ sobre OCR e LPR, e dependências de concentração de combustíveis, drogas e toxinas^20,21. Além disso, embora tenhamos limitado a análise das frações de escoamento à medida do lactato e ao cálculo do RLF, o conteúdo de informação de um experimento aumenta muito se forem ensaiados múltiplos compostos e classes de compostos nas frações de escoamento, como hormônios, neurotransmissores, sinais celulares e metabólitos que podem sair das células^{20,22, 23º}.

O carregamento de retina isolada ou EPR-coróide-esclera é simples e, uma vez isolados, esses tecidos são simplesmente colocados no topo das câmaras de tecido com pinça e deixados afundar até a frita. Células de EPR cultivadas em pastilhas de filtro desenvolvem polarização apropriada e marcadores de maturidade de EPR após 4-8 semanas em cultura. Não é viável remover o EPR para análise de células vivas uma vez aderido à membrana de transwell, se quisermos manter a maturidade e a polarização do EPR²⁴. A câmara de perifusão pode acomodar tiras da membrana transwell que são cortadas com bisturi enquanto submersas em tampão e rapidamente inseridas nas câmaras de tecido. Embora as tiras filtrantes de corte tenham sido colocadas em um sistema estático²⁴, nenhum outro método fluídico para avaliar esses importantes tipos celulares está disponível. As respostas das células do EPR foram rápidas e mais dinâmicas do que a retina ou a EPR-coróide-esclera, provavelmente devido em parte ao acesso imediato dos aspectos apicais e basais das células do EPR configurados como uma monocamada na inserção da membrana.

Outro fator para garantir que os dados tenham o maior sinal para ruído é selecionar a proporção ideal de tecido carregado nas câmaras de perifusão em relação à taxa de fluxo. Muito pouco tecido em relação à taxa de fluxo resulta em uma diferença de concentração de O₂ dissolvido entre entrada e saída que é muito pequena e difícil de medir de forma confiável. Em contraste, se o fluxo é muito lento, então a concentração de O₂ torna-se tão baixa que o tecido é afetado por hipóxia. No entanto, o fluxo de líquido impulsionado pela pressão do gás pode ser mantido em taxas de fluxo de até 5 mL/min, exigindo apenas pequenas quantidades de tecido para medições precisas de OCR e LPR. Nos experimentos aqui mostrados, foram utilizados cerca de 20 mL/min/canal, o que foi adequado para uma retina, duas escleras de EPR ou 360.000 células de EPR. Para minimizar os efeitos do sistema que retardam e dispersam a exposição do tecido ao composto teste injetado, vários tamanhos das câmaras de tecido são fornecidos, de modo que a quantidade de tecido (e a taxa de fluxo) seja combinada com o tamanho apropriado da câmara.

Os dados das análises apresentadas neste trabalho foram representados de duas maneiras: magnitude absoluta em relação à taxa, ou mudanças fracionárias em relação a um estado estacionário ou linha de base. O foco foi a ilustração da mensuração das respostas aos compostos de teste. No entanto, o sistema fluídico é adequado para avaliar e comparar os efeitos do tratamento tecidual antes da análise de perifusão, como modificações genéticas. Testar se um tratamento é diferente do controle é mais robusto se os efeitos do tratamento sobre as respostas normalizadas dos compostos de teste forem analisados. Se a análise requer magnitudes absolutas, o poder estatístico das análises de espécimes pré-tratados é maximizado se sua avaliação e controles forem realizados no mesmo experimento de perfusão.

Com exceção do agitador, todas as peças que entram em contato com o líquido são fornecidas pelo fabricante como consumíveis e foram esterilizadas. Essas peças não devem ser reutilizadas, pois experimentos ocasionalmente serão perdidos devido à limpeza incompleta e superfícies contaminadas. O sistema no início da configuração é estéril. No entanto, meios são adicionados à MRM, e o tecido é carregado nas câmaras em condições não estéreis. Medimos OCR no sistema que é montado com peças estéreis, mas onde o experimento em si é realizado em condições não estéreis. Leva cerca de 14 h para que as bactérias se acumulem a ponto de ter OCR mensurável (resultados não publicados). Se forem usados protocolos com menos de 10 h ou mais, o acúmulo de bactérias e quaisquer efeitos devido a elas serão insignificantes.

Muitos pesquisadores utilizam instrumentos que são projetados para medir OCR sob incubação estática de uma monocamada de células com um rendimento relativamente alto^25,26. Em contraste, o instrumento fluídico que testamos e descrevemos neste trabalho mantém o tecido, garantindo a liberação adequada de_O2, que é crítica para as maiores distâncias de difusão presentes nos espécimes teciduais. Além disso, é capaz de coletar frações permitindo a avaliação de múltiplos parâmetros em paralelo com o OCR, o que aumenta muito a capacidade de estudar relações entre eles. Finalmente, as concentrações de gás dissolvido (como O 2 e CO 2) podem ser controladas, aumentando a duração dos experimentos com meios à base de bicarbonato e tampão, permitindo ao usuário estudar os efeitos do O₂. Deve-se ressaltar que uma limitação para ambas as metodologias é a impossibilidade de estudar o washout dos compostos de teste, funcionalidade que outros sistemas de perifusão possuem4,27,28. Outra consideração ao determinar a modalidade ótima de análise é o fato de que os sistemas fluídicos usam mais meios e compostos de teste do que os sistemas estáticos. O gasto extra é minimizado com os sistemas fluídicos atuais, devido às baixas taxas de vazão que o sistema pode ser usado.

De modo geral, descreve-se uma descrição detalhada dos protocolos para a realização de experimentos com um novo instrumento de fluxo/avaliação. Os dados gerados com retina e PSE-coróide-esclera recapitularam resultados anteriores obtidos com sistemas muito mais difíceis de usar (e não prontamente disponíveis). Também foi demonstrado que o sistema pode manter e avaliar células de EPR aderidas a membranas transwell, um modelo celular muito importante que não foi previamente analisado com sistemas de fluxo devido à fragilidade das células. As partes principais do protocolo consistem em um tempo de setup de 75 min, seguido por um período de equilíbrio de 90 min e o protocolo experimental tornando-o adequado para uso rotineiro por laboratórios não especializados na operação de sistemas fluídicos. Embora tenhamos nos concentrado em medir a resposta aguda do tecido a compostos de teste, o sistema é muito adequado para comparar tecidos de várias fontes, como modelos animais ou modelos de células que foram geneticamente alterados ou submetidos a tratamentos/condições de teste. Além disso, o escopo de ensaios que podem ser conduzidos sobre as frações de saída são abrangentes e incluem metabólitos, moléculas de sinalização celular e hormônios/neurotransmissores secretados, bem como análises multicomponentes geradas por espectrometria de massa nas frações, bem como no tecido.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BIOLOGICAL SAMPLES
C57BL/6J mice	Envigo Harlan (Indianapolis, IN)	N/A
REAGENTS
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920L9795
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270G
KCN	Sigma-Aldrich	60178
Lactate	MilliporeSigma	L6661
Oliigomycin A	Sigma-Aldrich	75351L9795
CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING
Beuthanasia-D	Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ	N/A
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A3059
Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital	Virbac	RXEUTHASOL
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	12303C
Hank’s Buffered Salt Solution	GIBCO	14065056
Krebs Ringer Bicarbonate (KRB)	Thermo Fisher Scientific	J67795L9795
Matrigel	ThermoFisher	#CB-40230
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140122
ROCKi	Selleck Chemicals	Y-27632
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	#25-200-072
SUPPLIES
Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2	Praxair Distribution, Inc	N/A
Transwell filters	MilliporeSigma	3470
COMMERCIAL ASSAYS
Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit	ThermoFisher	A22189
Glucose Oxidase from Aerococcus viridans	Invitrogen (Carlsbad, CA)	A22189L9795
Lactate Oxidase	Sigma-Aldrich	L9795
EQUIPMENT
BaroFuse  Multi-Channel Perifusion system	EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA	Model 001-08
Synergy 4 Fluorometer	BioTek (Winooski, VT)	S4MLFPTA