이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, R01 GM148741 I.R.S.), U01 EY034591, R01 EY034364, 브라이트포커스 재단(BrightFocus Foundation), 실명 예방 연구(Research to Prevent Blindness, J.R.C.) 및 R01 EY006641, R01 EY017863 및 R21 EY032597(J.B.H.)의 보조금으로 지원되었습니다.

조직과 세포를 유지하고 평가하기 위한 펌프리스 다중 채널 흐름 배양

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	<li>Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perifusion+of+isolated+rat+islets+in+vitro:+Participation+of+the+microtubular+system+in+the+biphasic+release+of+insulin.">Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin.</a> Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).</li><li>Doliba, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+ionic+coupling+factors+in+amino+acid-stimulated+insulin+release+in+pancreatic+beta-HC9+cells.">Metabolic and ionic coupling factors in amino acid-stimulated insulin release in pancreatic beta-HC9 cells.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (6), E1507-E1519 (2007).</li><li>Sweet, I. 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I.R.S., M.G. 및 K.B.는 이 연구에 설명된 BaroFuse perifusion 시스템의 제조업체/유통업체인 EnTox Sciences, Inc.(Mercer Island, WA)와 재정적 관계를 맺고 있습니다. 다른 모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

세포 기능과 눈의 다양한 구성 요소 유지의 모든 측면에서 생체 에너지학의 중요성으로 인해 생체 에너지의 조절을 연구하는 방법이 매우 필요합니다. 특히, 신경 망막과 RPE는 에너지 생성뿐만 아니라 세포 내 및 세포 간 신호 전달을 위한 대사에 의존합니다14,15,16,17. 산화 능력이 높기 때문에, 눈의 고립된 조직은 정적인 조건 하에서 잘 유지되지 않으며,18,19 따라서 눈의 고립된 구성 요소에 대한 연구는 대사 과정을 유지하고 평가할 수 있는 흐름 시스템을 필요로 한다. 유체 시스템은 다양한 조직 유형에서 OCR 및 LPR 데이터를 생성하기 위해 개발되었으며, 이 백서에서는 최적의 결과를 생성하는 것으로 밝혀진 자세한 프로토콜을 제시했습니다.
유동 시스템을 사용하여 강력한 데이터를 생성하기 위한 주요 결정 요인에는 39°C에서 CO2 기반 매체/완충액의 사전 평형이 포함됩니다(실험 중에 가스를 제거할 수 있는 용존 가스로 페리푸세이트가 과포화되지 않도록 하기 위해). 특히, 4°C에서 보관된 배지 또는 KRB 완충액은 37°C에 비해 과포화되어 사전 평형 시간이 충분하지 않은 경우 실험 중에 가스가 제거됩니다. 또한, 조직 챔버에 로드된 조직은 조직의 찢어짐 또는 불완전한 분리로 인한 조직의 부적절한 분리로 인해 외상을 입지 않아야 하며, 소량의 중탄산염 기반 완충액에 있는 조직을 대기 공기에 너무 오래 노출시켜서는 안 됩니다. O2 검출의 온도 제어, 유량 안정성 및 신뢰성은 변동성이 거의 없으며 이러한 요인은 고장률에 크게 기여하지 않습니다.
이 기기에는 동시에 작동하는 8개의 유동 채널/조직 챔버가 있으며, 각 저장소마다 4개의 조직 챔버가 있는 2개의 저장소에서 페리푸세이트가 공급됩니다. OCR의 가장 정확한 시간 경과를 얻기 위해 운동 곡선은 조직이 로드되지 않은 챔버에 의해 기준선을 보정합니다. 따라서 일반적인 실험 프로토콜에는 3개의 조직 챔버로 구성된 두 그룹이 포함됩니다. 프로토콜은 일반적으로 두 가지 범주로 나뉩니다: 하나는 양쪽에 있는 서로 다른 테스트 화합물 프로토콜입니다(예: MRM의 한쪽에는 약물/차량, 다른 쪽에는 차량만 있음). 두 번째는 MRM의 양쪽에서 동일한 테스트 화합물 주입 프로토콜이지만 MRM의 양쪽에서 다른 조직 또는 조직 모델입니다. 이 논문에서는 올리고마이신과 FCCP가 망막에 미치는 영향을 시험 화합물에 노출되지 않은 조직별로 OCR과 비교하고, 조직 특이적 거동을 확인하기 위해 동일한 프로토콜과 조건에서 두 조직을 동시에 평가했습니다. 후자는 이 연구에서 동일한 실험에서 망막에 비해 RPE-맥락막-공막에 의한 대사율의 동적 범위가 증가했음을 보여줌으로써 설명되었습니다. 다른 보고서에서는 OCR 및 LPR에 대한 다양한O2 수준의 영향과 연료, 약물 및 독소의 농도 의존성을 측정하는 것을 포함하여 더 넓은 범위의 연구 설계를 설명했습니다20,21. 또한, 유출 분율의 분석은 젖산의 측정과 LPR의 계산에 한정되어 왔지만, 유출 분율 내의 여러 화합물 및 부류의 화합물을 분석하면 세포를 빠져나갈 수 있는 호르몬, 신경전달물질, 세포 신호, 대사 산물등을 분석하면 실험의 정보 내용이 크게 증가하고, 23.
분리된 망막 또는 RPE-맥락막-공막의 하중은 간단하며, 일단 분리되면 이러한 조직은 집게를 사용하여 조직 챔버의 상단에 배치되고 프릿으로 가라앉을 수 있습니다. 필터 삽입물에서 배양된 RPE 세포는 배양 후 4-8주 후에 적절한 분극 및 RPE 성숙 마커를 개발합니다. RPE 성숙도 및 분극이 유지되어야 하는 경우, 트랜스웰 멤브레인에 부착된 살아있는 세포 분석을 위해 RPE를 제거하는 것은 실현 가능하지 않다24. 주위 챔버는 완충액에 잠긴 상태에서 메스로 절단되고 조직 챔버에 빠르게 삽입되는 트랜스웰 멤브레인 스트립을 수용할 수 있습니다. 절단 필터 스트립이 정적 시스템(24)에 배치되었지만, 이러한 중요한 셀 유형을 평가하기 위한 다른 유체 방법은 이용가능하지 않다. RPE 세포의 반응은 망막 또는 RPE-맥락막-공막보다 빠르고 역동적이었는데, 이는 부분적으로 막 삽입부에서 단층으로 구성된 RPE 세포의 정점 및 기저 측면에 즉시 접근했기 때문일 수 있습니다.
데이터가 가장 높은 신호 대 잡음비를 갖도록 하는 또 다른 요소는 유속을 기준으로 융합 주위 챔버에 로드된 조직의 최적 비율을 선택하는 것입니다. 유속에 비해 조직이 너무 적으면 유입과 유출 사이의 용존O2 농도 차이가 매우 작아 안정적으로 측정하기 어렵습니다. 대조적으로, 흐름이 너무 느리면 O2 의 농도가 너무 낮아져 조직이 저산소증의 영향을받습니다. 그럼에도 불구하고 가스 압력 구동 액체 흐름은 정확한 OCR 및 LPR 측정을 위해 소량의 조직만 필요하므로 최저 5mL/분의 유속으로 유지할 수 있습니다. 여기에 표시된 실험에서는 약 20mL/분/채널이 사용되었으며, 이는 하나의 망막, 두 개의 RPE-맥락막-스클레라 또는 360,000개의 RPE 세포에 적합했습니다. 주입된 테스트 화합물에 대한 조직의 노출을 지연시키고 분산시키는 시스템 효과를 최소화하기 위해 여러 크기의 조직 챔버가 제공되어 조직의 양(및 유속)이 챔버의 적절한 크기와 일치합니다.
이 논문에 표시된 분석의 데이터는 속도에 대한 절대 크기 또는 정상 상태 또는 기준선에 대한 부분 변화의 두 가지 방식으로 표현되었습니다. 초점은 테스트 화합물에 대한 반응 측정의 그림이었습니다. 그러나 유체 시스템은 유전자 변형과 같은 주융 분석 전에 조직 처리의 효과를 평가하고 비교하는 데 매우 적합합니다. 치료가 대조군과 다른지 여부를 테스트하는 것은 테스트 화합물의 정규화된 반응에 대한 처리의 효과를 분석하는 경우 가장 강력합니다. 분석에 절대 크기가 필요한 경우, 전처리된 표본 분석의 통계적 검증력은 평가 및 대조가 동일한 융합 주위 실험에서 수행될 경우 극대화됩니다.
교반기를 제외하고 액체와 접촉하는 모든 부품은 제조업체에서 소모품으로 공급하며 멸균 처리되었습니다. 이러한 부품은 불완전한 세척과 오염된 표면으로 인해 실험이 손실되는 경우가 있으므로 재사용해서는 안 됩니다. 설정 초기의 시스템은 멸균 상태입니다. 그러나 배지가 MRM에 추가되고 조직은 비멸균 조건에서 챔버에 로드됩니다. 멸균 부품으로 조립되었지만 실험 자체가 비멸균 조건에서 수행되는 시스템에서 OCR을 측정했습니다. 박테리아가 측정 가능한 OCR(미공개 결과)을 가질 때까지 축적되는 데 약 14시간이 걸립니다. 10시간 미만의 프로토콜을 사용하는 경우 박테리아 축적 및 이로 인한 영향은 무시할 수 있습니다.
많은 연구자들은 상대적으로 높은 처리량을 가진 세포 단층의 정적 배양 하에서 OCR을 측정하도록 설계된 기기를 사용합니다25,26. 대조적으로, 이 논문에서 테스트하고 설명한 유체 기기는 조직 표본에 존재하는 더 큰 확산 거리에 중요한 적절한O2 전달을 보장하여 조직을 유지합니다. 또한 분수를 수집할 수 있어 OCR과 병행하여 여러 매개변수를 평가할 수 있어 매개변수 간의 관계를 연구하는 능력이 크게 향상됩니다. 마지막으로, 용존 가스 농도 (예 : O 2 및 CO 2 )를 제어하여 중탄산염 기반 매체 및 완충액을 사용한 실험 시간을 늘려 사용자가 O2 의 효과를 연구 할 수 있도록합니다. 두 방법론 모두에 대한 한계는 다른 주융 시스템이 4,27,28을 가지고 있는 기능인 테스트 화합물의 세척을 연구할 수 없다는 것입니다. 최적의 분석 방식을 결정할 때 고려해야 할 또 다른 사항은 유체 시스템이 정적 시스템보다 더 많은 매체와 테스트 화합물을 사용한다는 사실입니다. 추가 비용은 현재 유체 시스템을 사용하면 시스템을 사용할 수 있는 낮은 유속으로 인해 최소화됩니다.
전반적으로, 새로운 흐름/평가 기기로 실험을 수행하기 위한 프로토콜에 대한 자세한 설명이 설명되어 있습니다. 망막과 RPE-맥락막-공막으로 생성된 데이터는 사용하기가 훨씬 더 어려운(그리고 쉽게 구할 수 없는) 시스템으로 얻은 이전 결과를 요약했습니다. 또한 이 시스템은 트랜스웰 멤브레인에 부착된 RPE 세포를 유지하고 평가할 수 있으며, 이는 세포의 취약성으로 인해 이전에 유동 시스템으로 분석되지 않은 매우 중요한 세포 모델입니다. 프로토콜의 주요 부분은 75분의 설정 시간, 90분의 평형 기간 및 실험 프로토콜로 구성되어 유체 시스템 작동을 전문으로 하지 않는 실험실에서 일상적으로 사용하기에 적합합니다. 우리는 테스트 화합물에 대한 조직의 급성 반응을 측정하는 데 중점을 두었지만 이 시스템은 유전적으로 변형되었거나 테스트 처리/조건을 거친 동물 모델 또는 세포 모델과 같은 다양한 출처의 조직을 비교하는 데 매우 적합합니다. 또한 유출 분획에 대해 수행할 수 있는 분석의 범위는 광범위하며 대사 산물, 세포 신호 분자 및 분비된 호르몬/신경 전달 물질뿐만 아니라 분획 및 조직에 대한 질량 분석법에 의해 생성된 다성분 분석을 포함합니다.

주위 융합 시스템은 생명 과학 분야에서 오랜 역사를 가지고 있습니다. 특히, 섬에 의한 분비 기능 연구를 위해 분비물에 대한 반응으로 인슐린 분비의 동역학을 규명하는 데 사용되어 왔다1. 호르몬 및 대사 산물의 후속 분석을 위해 유출 분획을 수집하는 것 외에도 주로 산소 소비량감지를 위해 실시간 센서가 통합되었습니다 2,3,4. 눈의 질환을 매개하는 기전을 더 잘 이해하기 위한 광범위한 노력은 망막, 망막 색소 상피(RPE)-맥락막-공막 및 배양된 RPE 세포를 포함한 눈의 다양한 분리된 구성 요소의 대사 조절 및 조절 장애를 평가하기 위한 생리학적으로 관련된 방법의 부족으로 인해 제한되었습니다. 배양된 세포를 위해 설계된 정적 시스템은 조직5에 맞게 조정되었지만, 조직에는 적절한 산소 공급을 위한 흐름이 필요합니다. 유량 시스템은 망막 및 RPE-맥락막-공막에 의한 산소 소비율(OCR)의 실시간 반응을 정확하고 재현성 있게 측정하는 데 성공했으며, 조직은 8시간 이상 대사적으로 안정적으로 유지되어 여러 테스트 화합물을 포함하는 매우 유익한 프로토콜을 가능하게 합니다 4,6,7,8,9 . 그럼에도 불구하고 유체 시스템의 작동에는 역사적으로 맞춤형 장치와 표준화되지 않은 방법론에 대한 훈련된 기술 직원이 필요했습니다. 이러한 시스템은 대부분의 실험실에서 표준 방법론으로 채택되지 않았습니다. BaroFuse는 새로 개발된 유체 시스템으로, 펌프가 아닌 가스 압력에 의존하여 여러 채널과 조직 챔버를 통해 흐름을 유도합니다(그림 1). 각 채널은 OCR을 위해 지속적으로 모니터링되며, 후속 내용물 분석을 위해 플레이트 기반 분획 분취기로 유출을 수집합니다. 중요한 것은 기기의 조직 주위 챔버가 다양한 형상과 크기의 조직을 수용할 수 있도록 설계되었다는 것입니다.
이 기기의 핵심은 유체 시스템으로, 밀폐된 가압 저장소에서 작은 내경(ID) 튜브(유체 회로에서 가장 큰 흐름 저항을 제공함)를 통해 조직을 수용하는 유리 조직 챔버로 흐름이 구동됩니다. 매체 저장소 모듈(MRM)에 대한 압력은 가스 혼합물(일반적으로 21% O2, 5% CO2, 균형N2)을 포함하는 가스 실린더에 연결된 저압 및 고압 조절기에 의해 공급되며, 저장소는 조직 챔버 어셈블리(TCA)를 고정하는 주입 주변 챔버 모듈(PCM)에 의해 상단에서 밀봉됩니다. 유량은 저항 튜브의 길이와 ID 및 저압 조절기의 압력 설정에 의해 제어됩니다. 조직 챔버 상단에 연결된 유출 튜브는 유체를 폐기물 용기(유속의 자동 측정을 위해 지속적으로 계량됨) 또는 분획 분취기에 의해 제어되는 96웰 플레이트의 웰로 전달합니다. O2 검출 시스템은 조직 하류의 각 유리 조직 챔버 내부에 도색된O2 감응성 염료의 수명을 측정합니다. 그런 다음 이 정보를 사용하여 OCR을 지속적으로 계산합니다. 전체 유체 시스템은 온도 제어 인클로저에 상주하며 가스 탱크, 분획 분취기 및 컴퓨터는 기기의 주요 구성 요소입니다(그림 2A). 마지막으로, 기기를 실행하는 소프트웨어는 작동(주입된 테스트 화합물의 준비 및 타이밍, 유량 측정 시스템 및 분획 분취기 타이밍 포함)을 제어하고 OCR 데이터 및 기타 추가 측정을 처리 및 그래프로 표시하는 역할을 합니다.
이 논문에서는 유체 시스템을 사용하여 눈의 다양한 분리 구성 요소에 대한 OCR 및 젖산 생산 속도(LPR)를 주변 및 평가하기 위한 프로토콜을 설명합니다. LPR은 OCR을 매우 보완하는 해당과정(glycolytic rate)을 반영하는 파라미터이며, 여기서 쌍은 세포(10) 내의 탄수화물로부터의 에너지 생성의 두 가지 주요 지점을 설명한다. 조직을 준비하고 조직 챔버에 로드하는 것은 절차를 통해 가장 잘 배울 수 있으므로 비디오는 텍스트만으로는 쉽게 전달할 수 없는 설정 및 작동 중에 수행되는 몇 가지 중요한 단계를 설명하는 데 도움이 됩니다.
프로토콜에 대한 설명은 실험의 여러 단계에 해당하는 8개의 섹션으로 나뉩니다(그림 2B): 1. 실험 전 준비; 2. perifusate의 준비/평형; 3. 기기 설정; 4. 조직 평형; 5. 실험적 프로토콜; 6. 계기 고장; 7. 데이터 처리; 및 8. 유출 분획 분석.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BIOLOGICAL SAMPLES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J mice</td>
			<td>Envigo Harlan (Indianapolis, IN)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REAGENTS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCN</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>L6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oliigomycin A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75351L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL CULTURE AND TISSUE HARVESTING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beuthanasia-D</td>
			<td>Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Euthasol, 390 mg/ml sodium pentobarbital</td>
			<td>Virbac</td>
			<td>RXEUTHASOL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>14065056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krebs Ringer Bicarbonate (KRB)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J67795L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>#CB-40230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCKi&#160;</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>Y-27632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>#25-200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUPPLIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Cylinders: 21% O2/5% CO2/balance N2</td>
			<td>Praxair Distribution, Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell filters&#160;</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>3470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMMERCIAL ASSAYS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22189</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aerococcus viridans</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>A22189L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactate Oxidase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L9795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaroFuse&#160; Multi-Channel Perifusion system</td>
			<td>EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA</td>
			<td>Model 001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synergy 4 Fluorometer</td>
			<td>BioTek (Winooski, VT)</td>
			<td>S4MLFPTA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

maintaining and assessing various tissue and cell types of the eye using a novel pumpless fluidics system

조직 기능 및 세포 생물학을 조사하는 데 사용되는 많은 시험관 내 모델에는 기능 및 생존력 유지에 필요한 적절한 산소 공급과 최적의 세포 조건을 제공하기 위해 배지 흐름이 필요합니다. 이를 위해 당사는 배양 중인 조직과 세포를 유지하고 인라인 센서 및/또는 유출 분획 수집을 통해 기능과 생존력을 지속적으로 평가하기 위한 다중 채널 유동 배양 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 산소 소비율에 대한 8채널 연속 광학 감지와 내장된 분획 분취기를 결합하여 대사 산물의 생산 속도와 호르몬 분비를 동시에 측정합니다. 섬, 근육 및 시상하부를 포함한 광범위한 조직 및 세포 모델을 유지하고 평가할 수 있지만, 여기서는 분리된 마우스 망막, 마우스 망막 색소 상피(RPE)-맥락막-공막 및 배양된 인간 RPE 세포의 생체 에너지 조절을 조사하는 데 사용한 작동 원리와 실험 준비/프로토콜을 설명합니다. 펌프가 없는 유체 흐름과 같은 시스템 설계의 혁신은 다중 채널 흐름 시스템의 작동을 크게 단순화했습니다. 실험을 위해 기기를 조립하고, 준비하고, 다양한 조직/세포 모델을 융합 주위 챔버에 로드하는 방법을 보여주는 비디오와 이미지가 표시됩니다. 또한 일관되고 안정적인 배양 조건을 얻기 위한 올바른 유속 대 조직 비율 설정과 소비 및 생산 속도의 정확한 결정을 포함하여 프로토콜 및 조직 특이적 실험을 위한 조건 선택 지침을 설명하고 논의합니다. 최적의 조직 유지 관리와 여러 매개변수의 실시간 평가의 조합은 눈의 생리학 연구 및 시력 장애 치료를 위한 약물 발견에 큰 도움이 될 매우 유익한 데이터 세트를 생성합니다.

Perifusion systems have a long history in the life sciences. In particular, for the study of secretory function by islets, they have been used to characterize the kinetics of insulin secretion in response to secretagogues1. In addition to collecting outflow fractions for subsequent assay of hormones and metabolites, real-time sensors have been incorporated, predominantly for the detection of oxygen consumption2,3,4. Widespread efforts to better understand mechanisms mediating diseases of the eye have been limited by a lack of physiologically relevant methods to assess metabolic regulation and dysregulation of the various isolated components of the eye, including the retina, retinal pigment epithelial (RPE)-choroid-sclera and cultured RPE cells. Static systems designed for cultured cells have been adapted for tissue5, but tissue requires flow for adequate oxygenation. Flow systems have been successful at accurately and reproducibly measuring real-time responses in oxygen consumption rate (OCR) by the retina and RPE-choroid-sclera, and the tissues stay metabolically stable for more than 8 h allowing highly informative protocols involving multiple test compounds4,6,7,8,9. Nonetheless, the operation of fluidics systems has historically required a custom-made apparatus and trained technical staff in non-standardized methodologies. Such systems have not been adopted as the standard methodology in most laboratories. The BaroFuse is a newly developed fluidics system that does not rely on pumps, but rather on gas pressure to drive flow through multiple channels and tissue chambers (Figure 1). Each channel is continuously monitored for OCR, and the outflow is collected with a plate-based fraction collector for subsequent assay of contents. Importantly, the tissue perifusion chambers for the instrument are designed to accommodate tissues of various geometries and sizes.
The heart of the instrument is the fluidics system, where flow is driven from a sealed, pressurized reservoir through small inner diameter (ID) tubing (contributing the most significant flow resistance in the fluid circuit) up into the glass tissue chambers that house the tissue. Pressure to the media reservoir module (MRM) is supplied by low-pressure and high-pressure regulators connected to a gas cylinder containing a mixture of gases (typically 21% O2, 5% CO2, balance N2), and the reservoir is sealed from the top by the perifusion chamber module (PCM) that holds the tissue chamber assemblies (TCAs). Flow rate is controlled by the length and ID of the resistance tubes and the pressure setting of a low-pressure regulator. Outflow tubes connected to the top of tissue chambers deliver fluid to either a waste receptacle (that is continuously weighed for automatic determination of flow rate) or into wells of a 96-well plate controlled by the fraction collector. The O2 detection system measures the lifetime of an O2-sensitive dye painted on the inside of each of the glass tissue chambers downstream of the tissue. This information is then used to continuously calculate OCR. The entire fluidics system resides in a temperature-controlled enclosure and the gas tank, fraction collector and computer are the major components of the instrument (Figure 2A). Finally, software that runs the instrument serves to control its operation (including the preparation and timing of injected test&#160;compounds, flow measurement system, and fraction collector timing), as well as processing and graphing the OCR data and other supplemental measurements.
In this paper we describe the protocols for using the fluidics system to perifuse and assess OCR and lactate production rate (LPR) for various isolated components of the eye. LPR is a parameter reflecting glycolytic rate that is highly complementary to OCR, where the pair accounts for the two major branches of energy generation from carbohydrates in the cell10. As preparation of the tissue and loading it into the tissue chambers is best learned by watching the procedure, the video will help illustrate several of the critical steps that are performed during set up and operation that are not easily conveyed by text alone.
The description of the protocol is divided up into 8 sections that correspond to different phases of the experiment (Figure 2B): 1. pre-experimental preparation; 2. preparation/equilibration of the perifusate; 3. instrument set up; 4. tissue equilibration; 5. experimental protocol; 6. instrument break down; 7. data processing; and 8. assays of outflow fractions.

저자 스포트라이트: 최적의 조직 유지 관리 및 실시간 평가를 위한 다중 채널 흐름 배양을 통한 안구 생리학 연구 발전 

새로운 펌프리스 유체 시스템을 사용한 눈의 다양한 조직 및 세포 유형 유지 및 평가

The most common devices used for measuring oxygen consumption don't support the simultaneous collection of outflow fractions. It's critical to also assay outflow to correlate metabolism with tissue function. Technology's measuring both can better assess cellular mechanisms mediating tissue function and disease.The key challenge in measuring oxygen consumption and live tissue is delivering adequate oxygen to maintain tissue viability and function. This is best accomplished with flow systems. Utilizing gas pressure instead of standard peristaltic pumps greatly simplifies the procedure and also eliminates bubble formation.The utility of a metabolic measurement is only as good as its ability to quantify and reproduce the results. Our protocol leverages the combination of precisely controlled flow rate with stable lifetime detection of dissolved oxygen in both inflow and outflow. This approach can reproducibly resolve changes in oxygen consumption of even just a few percent.The biochemical processes mediating retinal function are the result of the metabolic interplay between various tissue of the eye. The ability of our flow system to assess multiple tissue types with diverse geometries facilitates the study of the unique intrinsic properties of each cell type and their coordinated functions. Many diseases afflicting the eye are caused by impaired metabolic pathways and signaling.We are focusing on measuring the oxygen consumption and the release of metabolic byproducts by eye tissues in order to characterize, understand and treat the development of retinal diseases and degeneration.

눈의 분리된 구성 요소로부터 생성된 데이터의 해상도를 설명하기 위해, OCR 및 LPR은 일반적으로 사용되는 프로토콜(미토콘드리아 스트레스 테스트10; 그림 10, 그림 11 및 그림 12). 각 조직에 사용되는 조직의 양은 표 1에 나와 있습니다. 데이터는 유체 시스템용으로 개발된 소프트웨어 패키지를 사용하여 처리되고 그래프로 표시되었습니다. 망막과 RPE-맥락막-공막의 준비는 비교적 간단하며 각 조직 유형에 대해 20분 미만이 소요됩니다. OCR은 테스트 화합물이 주입되는 동안 일정하여 조직의 안정적인 건강과 기능을 나타내고 방법의 타당성을 뒷받침합니다(그림 10). 각 조직 유형에 대해 검증한 후에는 각 실험에 대해 테스트 화합물이 주입되지 않는 대조군을 실행할 필요가 없다는 것을 발견했습니다. 보다 종래의 주융 방법(6,8,13)을 사용하여 얻은 데이터와 일치하며, 올리고마이신에 대한 반응으로 OCR이 감소하고 FCCP에 반응하여 OCR이 증가합니다. LPR의 변화는 OCR에서 관찰된 변화와 반대 방향으로, 올리고마이신은 LPR을 증가시켰고, FCCP에 대한 반응으로 감소했습니다(그러나 약간만). 각 순차 테스트 화합물의 효과에 대한 통계적 유의성을 비교하기 위해 t-검정을 수행했습니다(기기와 함께 제공되는 소프트웨어에 의해 자동으로 계산됨). 논문의 목표가 방법을 수행하는 방법을 설명하는 것이었기 때문에 수행된 반복실험 횟수가 통계적 유의성을 산출할 만큼 항상 높지는 않았습니다. 그러나 일반적으로 반복횟수가 3회 이상인 경우 FCCP와 올리고마이신이 OCR과 LPR 모두에 미치는 영향은 유의했습니다.
RPE 세포는 이전에 유동 시스템으로 분석되지 않았지만 RPE-맥락막-공막과 유사하게 반응했습니다(OCR의 상당 부분이 RPE 세포에 기인한다는 견해와 일치함; 그림 11). 이러한 예시적인 예는 제어 채널에서 OCR의 안정성에 의해 반영된 조직 생존력을 유지하는 시스템의 능력과 올리고마이신 및 FCCP에 의해 유도된 크기의 OCR 변화에 대한 높은 신호 대 잡음비(100:1 이상)를 강조합니다. 또한, 유출 분획 분석은 OCR(이 경우 LPR)을 보완하는 세포외 유체와 교환되는 다양한 화합물의 흡수 또는 생산 속도를 상호 연관시키는 데 사용할 수 있습니다. 기기의 이러한 기능을 통해 병렬로 수행된 조직 유형 간 조직 반응의 특성 차이를 정확하게 정량화할 수 있었습니다. RPE-맥락막-공막 및 RPE 세포에 의한 OCR은 망막보다 올리고마이신에 일관되게 더 민감하지만(그림 11 및 그림 12), RPE-맥락막-공막의 경우 FCCP에 노출되는 기간이 정상 상태에 도달할 만큼 충분히 길지 않았습니다. DMSO를 용매로 사용할 때 고려해야 할 사항이 있습니다. 더 높은 농도에서(0.2%) DMSO는 망막에 의한 OCR에 일시적인 영향을 미쳤습니다(아마도 DMSO가 막 투과성에 미치는 영향으로 인한 삼투압 변화의 영향을 반영함).
KCN이 시토크롬 c 산화효소에 직접 작용하여 호흡을 완전히 억제한다는 가정에 기초하여, KCN 노출이 끝날 때의 OCR은 0으로 설정되고, 모든 OCR 값은 KCN 값에 대한 변화를 기준으로 계산된다. OCR은 호흡 사슬 및 시토크롬 c 산화효소와 무관하게 발생할 수 있습니다. 그러나 전체 OCR에 대한 이러한 기여의 크기는 일반적으로 몇 퍼센트를 넘지 않으며(데이터는 표시되지 않음) 조직이 KCN에 노출되는 시간이 길어지면 전자 수송 사슬의 일부가 아닌 산화효소의 기질이 고갈됩니다.
통계 분석 단일 실험은 그림에 표시된 대로 표시되었지만 평균화된 여러 채널을 사용했습니다. 그런 다음 데이터를 표준 오차(SE, SD/√n으로 계산)± 평균으로 그래프로 표시했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2.jpg"> 그림 1. 유체/평가 시스템의 개략도. 주요 구성 요소에는 인클로저, 온도 제어 요소, 유체 및 조직 챔버 시스템, 페리푸세이트 위의 헤드 공간에서 가스 압력 조절, 분획 수집기/유량 모니터링 및 O2 검출기가 포함됩니다. 약어: MRM = 미디어 저장소 모듈, PCM = 퓨전 주변 챔버 모듈, TCA= 조직 챔버 어셈블리. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig02.jpg"> 그림 2. (A) 기기의 주요 구성 요소 사진. 주요 구성 요소는 가스 탱크(압력 조절기), 인클로저, 분획 수집기 및 컴퓨터로 구성됩니다. (B) 단계의 주요 범주와 이를 완료하는 데 걸리는 시간을 보여주는 실험 순서도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig03.jpg"> 그림 3. MRM의 보기입니다. MRM 인서트(왼쪽)와 교반 막대(오른쪽)가 MRM 인서트의 하단(MRM 디바이더의 각 측면에 배치됨)에 배치된 MRM의 모습입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig04.jpg"> 그림 4. MRM의 튜빙 어셈블리 및 퍼지 튜빙 어셈블리. (A) MRM의 포트에 부착된 복합 주입 튜빙 어셈블리 및 퍼지 튜빙 어셈블리를 테스트합니다. (비씨) 시험 복합 사출 어셈블리와 퍼지 튜빙 어셈블리(B)는 인클로저(C) 전면의 홈에 배치됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig05.jpg"> 그림 5. MRM 온도 컨트롤러의 전원을 켭니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig06.jpg"> 그림 6. 조직 챔버 및 가스 탱크. 검출기 스탠드(MRM 및 PCM도 지원함)에 O2 검출기를 배치하고 조직 챔버를 제자리에 고정하는 데 도움이 되는 PCM의 핀 주위에 밴드를 배치합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig07.jpg"> 그림 7. (A) 가스 탱크의 고압 및 저압 조절기. (비씨) 퍼지 튜브. 퍼지 튜브를 사용하면 MRM의 헤드스페이스에서 공기가 제거되고 공급 탱크의 가스가 채워집니다. 열린 퍼지 튜브(B)와 닫힌 퍼지 튜브(C)를 보여주는 사진. 테스트 화합물 주입 어셈블리는 퍼지 프로세스를 통해 닫힌 상태로 유지됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig08v3.jpg"> 그림 8. 조직 챔버 및 유출 설정. (A) Transwell 멤브레인을 동일한 너비의 세 스트립으로 절단한 후의 치수. (B) 유출 다중 튜브 지원. (C) 조직 챔버 근처의 튜빙 어댑터와 함께 인클로저의 가장자리에 위치한 유출 다중 튜브 지지대. (D) 조직실에 부착된 유출 튜브 어셈블리의 사진. (E) 조감도 view 뚜껑이 없는 인클로저의 모습. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig08largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig09.jpg"> 그림 9. MRM에 화합물 주입. 5mL 주사기를 사용하여 주입 포트를 통해 MRM에 테스트 화합물을 주입합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig09large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig10.jpg"> 그림 10. 테스트 화합물에 대한 OCR 및 LPR 곡선. 표시된 테스트 화합물의 존재 또는 부재(대조군)에 대한 반응으로 마우스(1개의 망막/채널)에서 분리된 망막에 의한 OCR 및 LPR. 각 곡선은 단일 실험에서 6회 반복실험의 평균입니다(오차 막대는 SE이며, p-값은 각 테스트 에이전트의 정상 상태 값을 이전 테스트 에이전트의 정상 상태 값과 비교하는 쌍체 t-검정을 수행하여 계산됨). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig11.jpg"> 그림 11. OCR 곡선. 표시된 테스트 화합물에 대한 반응으로 병렬로 측정된 마우스(망막 1개 또는 RPE-맥락막-공막/채널)에서 분리된 RPE-맥락막-공막 및 망막에 의한 OCR. 데이터는 단일 실험의 반복실험 평균입니다(RPE-맥락막-공막 및 망막에 대해 각각 n = 2 및 4, p-값은 각 테스트 에이전트의 정상 상태 값을 이전 테스트 에이전트의 정상 상태 값과 비교하는 쌍체 t-검정을 수행하여 계산됨). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig11large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig12.jpg"> 그림 12. RPE 셀의 OCR 및 LPR 곡선. 스트립으로 절단되어 주입 주위 챔버에 로드된 트랜스웰 멤브레인에 부착된 RPE 세포의 OCR 및 LPR. 데이터는 단일 실험의 반복실험 평균입니다(n = 3, 1.5개의 멤브레인/채널(360,000개 셀/채널), p-값은 각 테스트 에이전트의 정상 상태 값을 이전 테스트 에이전트의 정상 상태 값과 비교하는 쌍체 t-검정을 수행하여 계산됨). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig12large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>조직/세포</td>
			<td>금액/채널</td>
			<td>유량: mL/min</td>
		</tr><tr><td>레티나(마우스)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.025</td>
		</tr><tr><td>RPE-맥락막-공막(마우스)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.02</td>
		</tr><tr><td>트랜스웰 멤브레인의 RPE 셀</td>
			<td>360,000셀(4 x 1/3 필터 스트립)</td>
			<td>0.016</td>
		</tr></tbody></table>표 1. 다른 조직에 대한 권장 작동 사양.
보충 그림 1. 실험 설계의 그래픽 표현. 테스트 화합물에 대한 노출 시기 및 구성, 분획 수집 시기. 농도 증가(Conc Inc)는 구현할 농도의 변화입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig1.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2. 시작 시 사용자 인터페이스. PCM에 삽입된 조직 챔버에서O2를 모니터링하는O2 검출 소프트웨어의 시작 창 UI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig2.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 3. 실험 설정을 위한 사용자 인터페이스. 실험 정보 입력(왼쪽)과 유출 분획 수집 시간 선택(오른쪽)을 위한 UI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig3.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 4. 삽입 페이지의 사용자 인터페이스입니다. 원하는 테스트 화합물 농도와 MRM에 남아 있는 부피를 기준으로 주입 부피를 계산하는 주입 페이지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig4.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 조직 시료 전처리 방법. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Eye Physiology Research via a Multi-Channel Flow Culture for Optimal Tissue Maintenance and Real-Time Assessment at JoVE.com

살아있는 조직의 실시간 분석은 중요한 기능 및 기계론적 데이터를 제공합니다. 이 백서에서는 광범위한 조직 및 세포 모델을 유지 관리하고 평가하는 새롭고 펌프가 필요 없는 다중 채널 유체 시스템을 통해 정확하고 재현 가능한 데이터 생성을 보장하기 위한 프로토콜과 중요한 변수에 대해 설명합니다.

Many in vitro models used to investigate tissue function and cell biology require a flow of media to provide adequate oxygenation and optimal cell ...

산소 소비량을 측정하는 데 사용되는 가장 일반적인 장치는 유출 분획의 동시 수집을 지원하지 않습니다. 또한 신진대사와 조직 기능의 상관 관계를 파악하기 위해 유출을 분석하는 것도 중요합니다. 이 두 가지를 모두 측정하는 기술은 조직 기능과 질병을 매개하는 세포 메커니즘을 더 잘 평가할 수 있습니다.산소 소비량과 살아있는 조직을 측정하는 데 있어 주요 과제는 조직의 생존력과 기능을 유지하기 위해 적절한 산소를 공급하는 것입니다. 이 작업은 유량 시스템을 사용하는 것이 가장 좋습니다. 표준 연동 펌프 대신 가스 압력을 사용하면 절차가 크게 간소화되고 기포 형성도 제거됩니다.대사 측정의 유용성은 결과를 정량화하고 재현하는 능력만큼만 우수합니다. 당사의 프로토콜은 정밀하게 제어된 유속과 유입 및 유출 모두에서 용존 산소의 안정적인 수명 감지의 조합을 활용합니다. 이 접근법은 단 몇 퍼센트의 산소 소비량 변화도 재현 가능하게 해결할 수 있습니다.망막 기능을 매개하는 생화학적 과정은 눈의 다양한 조직 간의 대사 상호작용의 결과입니다. 다양한 형상을 가진 여러 조직 유형을 평가할 수 있는 당사의 유동 시스템의 기능은 각 세포 유형의 고유한 고유 특성과 조정된 기능에 대한 연구를 용이하게 합니다. 눈을 괴롭히는 많은 질병은 신진대사 경로와 신호 전달의 손상으로 인해 발생합니다.우리는 망막 질환 및 퇴행의 발병을 특성화, 이해 및 치료하기 위해 눈 조직에 의한 산소 소비량과 대사 부산물의 방출을 측정하는 데 중점을 두고 있습니다.

새로운 펌프리스 유체 시스템을 사용한 눈의 다양한 조직 및 세포 유형 유지 및 평가

Abstract