Модель сосудистой ниши костного мозга in vitro создается путем посева мезенхимальных и эндотелиальных клеток на предварительно отлитые 3D-гидрогели ПЭГ. Эндотелиальные сети, компоненты ECM и активность ALP в нишах варьируются в зависимости от используемого фактора роста. Платформа может быть использована для продвинутых моделей рака.
Кость и костный мозг являются высоко васкуляризированными и структурно сложными органами и являются местами образования рака и метастазов. Крайне желательны модели in vitro , воспроизводящие специфические функции костей и костного мозга, включая васкуляризацию, которые совместимы с скринингом лекарств. Такие модели могут преодолеть разрыв между упрощенными, структурно нерелевантными двумерными (2D) моделями in vitro и более дорогими, этически сложными моделями in vivo . В этой статье описывается контролируемый трехмерный (3D) анализ совместной культуры на основе инженерных матриц из поли (этиленгликоля) (ПЭГ) для создания васкуляризированных остеогенных ниш костного мозга. Матричная конструкция PEG позволяет разрабатывать 3D-клеточные культуры с помощью простого этапа посева клеток, не требующего инкапсуляции, что позволяет разрабатывать сложные системы совместного культивирования. Кроме того, матрицы прозрачны и предварительно отлиты на 96-луночные пластины со стеклянным дном, что делает систему пригодной для микроскопии. Для анализа, описанного здесь, сначала культивируют мезенхимальные стромальные клетки, полученные из костного мозга человека (hBM-MSCs), до тех пор, пока не будет сформирована достаточно развитая сеть 3D-клеток. Впоследствии добавляются GFP-экспрессирующие эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC). Развитие культуры сопровождается светлопольной и флуоресцентной микроскопией. Наличие сети hBM-MSC поддерживает образование сосудистых структур, которые в противном случае не сформировались бы и остаются стабильными в течение как минимум 7 дней. Степень образования сосудистой сети может быть легко определена количественно. Эта модель может быть настроена на остеогенную нишу костного мозга путем дополнения питательной среды костным морфогенетическим белком 2 (BMP-2), который способствует остеогенной дифференцировке hBM-МСК, оцениваемой по повышенной активности щелочной фосфатазы (ЩФ) на 4-й и 7-й день совместной культуры. Эта клеточная модель может быть использована в качестве платформы для культивирования различных раковых клеток и изучения того, как они взаимодействуют с сосудистыми нишами, специфичными для костей и костного мозга. Кроме того, он подходит для автоматизации и анализа с высоким содержанием, что означает, что он позволит проводить скрининг лекарств от рака в условиях культуры с высокой воспроизводимостью.
Кость и костный мозг являются структурно и функционально сложными органами, занимающими центральное место в здоровье человека. Это отражается в существовании отдельных ниш, которые регулируют кроветворение и поддержание костной ткани1. В настоящее время широко признано, что в здоровом костном мозге поддержание и расширение гемопоэтических и скелетных стволовых клеток, а также их потомства контролируется отдельными нишами. Эти ниши включают различные типы клеток, включая остеолинейные клетки, мезенхимальные стволовые клетки, эндотелиальные и периваскулярные клетки, нейрональные и глиальные клетки, адипоциты, остеокласты, макрофаги и нейтрофилы2. Неудивительно, что эти в основном сосудисто-ассоциированные ниши также участвуют в развитии различных типов лейкемии3 и являются местом метастазирования различных видов рака4. Из-за своей специфической роли в формировании кости, ремоделировании и поддержании кости (костного мозга) сосудистая сеть, связанная с костью, имеет различные специализированные структуры, отличные от сосудистой сети, обнаруженной в других частях тела 5,6,7. Таким образом, антиангиогенные или сосудисто-модулирующие препараты, применяемые системно, могут оказывать различное действие в этих специализированных средах8. Поэтому очень желательны модели для исследования молекулярных механизмов, участвующих в поддержании физиологических свойств кости и костного мозга, регенерации костей и костного мозга, а также реакции на терапевтическое лечение.
Классические двумерные (2D) тканевые культуры и исследования in vivo с использованием животных моделей дали бесценное представление о роли различных клеток и молекулярных игроков, участвующих в развитии кости и костного мозга 9,10. Модели, которые позволяют проводить высокопроизводительные эксперименты с соответствующими клетками человека, могут улучшить наше понимание того, как модулировать выбранные параметры в этих очень сложных системах.
В последнее десятилетие для создания 3D-моделей тканей использовались принципы, полученные с помощью тканевой инженерии11,12. Они в основном основывались на инкапсуляции тканезависимых клеток в биоматериалы для создания 3D-моно- или кокультур13. Среди наиболее часто используемых биоматериалов - фибрин14, коллаген 15 и матригель16,17, все из которых обладают высокой биосовместимостью и обеспечивают соответствующие условия для роста многих типов клеток. Эти биоматериалы обладают способностью генерировать модели in vitro, которые повторяют ключевые аспекты различных сосудистых ниш, обнаруженных in vivo18. Кроме того, использование микрофлюидных устройств для создания перфузированных моделей сосудистой кости и костного мозга способствовало созданию моделей in vitro более высокой сложности 19,20,21,22.
Сложность контроля состава и инженерных свойств встречающихся в природе биоматериалов вдохновила на разработку синтетических аналогов, которые могут быть рационально спроектированы с предсказуемыми физическими, химическими и биологическими свойствами23,24. Мы разработали полностью синтетические сшитые гидрогели на основе сшитого поли(этиленгликоля) (ПЭГ) фактора XIII (FXIII), которые функционализированы пептидами RGD и сайтами расщепления матриксной металлопротеазы (MMP) для облегчения прикрепления и ремоделирования клеток25,26. Модульная конструкция этих биоматериалов успешно использована для оптимизации условий формирования 3D васкуляризированных моделей костей и костного мозга27,28.
Для тестирования большего количества различных условий культивирования и новых терапевтических средств требуются модели с более высокой пропускной способностью. Недавно мы показали, что сшивание FXIII нашего гидрогеля ПЭГ можно контролировать с помощью электрохимического процесса, так что образуется углубленный градиент жесткости гидрогеля29. Когда клетки добавляются поверх таких гидрогелей, они мигрируют внутрь и постепенно превращаются в тесно взаимосвязанные3D-сотовые сети 30. Устранение необходимости инкапсулировать клетки в гидрогель, который обычно присутствует с другими 3D-каркасами, не только упрощает экспериментальный дизайн, но и позволяет последовательно добавлять различные типы клеток в разные моменты времени для создания сложных систем совместного культивирования. Эти гидрогели доступны в предварительно отлитом виде на 96-луночные пластины со стеклянным дном, что позволяет создавать 3D-культуры как вручную, так и с помощью автоматизированных протоколов посева клеток. Оптическая прозрачность гидрогелей ПЭГ делает платформу совместимой с микроскопией.
Здесь мы представляем простой метод создания и характеристики васкуляризированных остеогенных ниш в рамках этой готовой к использованию синтетической платформы plug-and-play. Показано, что развитие сосудистых сетей может быть стимулировано фактором роста, обычно используемым для индукции остеогенеза in vitro, костным морфогенетическим белком-2 (BMP-2), в то время как остеогенная дифференцировка может быть предотвращена добавлением фактора роста фибробластов 2 (FGF-2)27,31. Сформированные сети отличаются по сравнению с FGF-2-стимулированными сетями с точки зрения общего внешнего вида, а также распределения ячеек и ECM. Кроме того, мы контролировали остеогенную индукцию, используя щелочную фосфатазу в качестве маркера. Мы демонстрируем повышенную экспрессию этого маркера с течением времени и сравниваем экспрессию с таковой в стимулированных сетях FGF-2 с использованием качественных и количественных методов. Наконец, мы демонстрируем пригодность сгенерированных ниш этой модели для двух потенциальных применений. Во-первых, мы провели экспериментальный анализ чувствительности к лекарственным средствам, добавив бевацизумаб в предварительно сформированные ниши и отслеживая деградацию сосудистых сетей в его присутствии. Во-вторых, мы добавили клетки рака молочной железы MDA-MB-231 и остеосаркомы U2OS в предварительно сформированные остеогенные ниши, показывая, что ниши могут быть использованы для изучения взаимодействия между раковыми клетками и окружающей их средой.
На рисунке 1 показаны следующие разделы протокола.
1. Создание 3D-стромальной монокультуры
2. Создание 3D-культуры стромально-эндотелиальных клеток
3. Процедура характеристики 1: Количественная оценка формирования сети эндотелиальных клеток
4. Процедура определения характеристик 2: Оценка осаждения ECM
5. Процедура характеристики 3: Оценка остеогенной дифференциации путем мониторинга активности ЩФ
6. Применение 1: Проведение анализов на чувствительность к лекарственным средствам
7. Приложение 2: Создание передовых систем совместного культивирования с различными типами раковых клеток
Посевы сосудистых ниш были установлены путем последовательного посева hBM-MSC и GFP-HUVEC на предварительно изготовленные гидрогели на основе ПЭГ с градиентом жесткости в 96-луночной пластине для визуализации (рис. 1). Культуры контролировали в продольном направлении с помощью живой эпифлуоресцентной микроскопии и дополнительно характеризовали в выбранные моменты времени. Внеклеточный компартмент оценивали с помощью прямого окрашивания цветом и окрашивания на основе антител. Активность ЩФ была количественно определена после извлечения и лизиса клеток из образовавшихся ниш. Кроме того, мы демонстрируем пригодность этой платформы для анализов чувствительности к антиангиогенным лекарственным средствам и в качестве основы для моделей совместного культивирования рака.
Кокультуры hBM-МСК и GFP-экспрессирующих HUVEC были установлены путем посева 3 x 104 клеток/лунка в отсутствие факторов роста или в присутствии FGF-2 или BMP-2 в дозе 50 нг/мл, как описано в протоколе. С самого начала различия между культурами можно было наблюдать как на изображениях яркого поля, так и на флуоресцентных изображениях, показывающих только GFP-HUVEC (рис. 2A). Наблюдая за одними и теми же участками в продольном направлении, можно отметить различия в развитии культур, такие как более быстрое развитие в присутствии FGF-2. Как правило, культуры казались менее развитыми в отсутствие какого-либо фактора роста, с меньшим количеством распространяющихся клеток любого типа и наличием бесклеточных областей. Напротив, снимки светлого поля показали наиболее плотные культуры в присутствии БМП-2. Однако сосудистые сети формировались как в условиях, содержащих фактор роста, так и наиболее обширные и взаимосвязанные сети формировались с FGF-2. Эти наблюдаемые различия также могут быть количественно оценены с помощью анализатора ангиогенеза для ImageJ. Действительно, общая протяженность сети была самой высокой при наличии FGF-2 и наименьшей при отсутствии факторов роста (рис. 2B). Количество развязок, указывающих на точки разветвления в сетях, соответствовало той же тенденции, что и общая длина (рис. 2C). И наоборот, в обоих условиях, содержащих фактор роста, было значительно меньше изолированных сегментов, что указывает на более высокую взаимосвязь, чем в условиях без какого-либо фактора роста (рис. 2D). Кроме того, 3D-конфокальная визуализация показала более сильное проникновение эндотелиальных клеток с точки зрения глубины в состоянии, стимулированном FGF-2 (рис. 2E).
Кокультуры hBM-MSC/GFP-HUVEC выдерживали в течение 7 дней в присутствии FGF-2 или BMP-2, а затем фиксировали и окрашивали для компонентов ECM. Иммуноцитохимическое окрашивание с последующей конфокальной лазерной сканирующей микроскопией показало поразительные различия в морфологии культуры в зависимости от типа добавки фактора роста (рис. 3А). При FGF-2 культура была организована в конденсированные микрососудистые структуры, которые были плотными как в эндотелиальных, так и в мезенхимальных клетках, тогда как в присутствии BMP-2 hBM-MSC охватывали гораздо большую площадь, о чем свидетельствуют более обширные F-актин-положительные и GFP-отрицательные области. Белки ECM фибронектин и коллаген I были локализованы аналогичным образом, в то время как ламинин и коллаген IV были более сконцентрированы вокруг эндотелиальных структур. Однако эта повышенная концентрация вокруг эндотелиальных структур была гораздо более выражена в присутствии FGF-2, чем в присутствии BMP-2. В дополнение к окрашиванию на основе антител были выполнены прямые цветные окрашивания для оценки общего фиброзного состояния ECM (окрашивание Picrosirius red; Рисунок 3Б), а также осаждение Ca на ECM (окрашивание Alizarin Red; Рисунок 3В) образовавшихся ниш. Окрашивание Picrosirius Red было более сильным и обширным в нишах, культивируемых с помощью БМП-2, и окрашивание Alizarin Red следовало той же тенденции.
Затем культуры были охарактеризованы с точки зрения их остеогенного потенциала путем оценки активности ALP как раннего остеогенного маркера. На 4-й и 7-й день совместного культивирования клетки извлекали из ниш путем переваривания гидрогелей с трипсином. Для количественной оценки активности ЩФ извлеченные клетки лизировали и проводили анализ pNPP. Полученные значения были нормализованы по отношению к общей ДНК для каждого образца, чтобы учесть потенциальные различия в количестве клеток в разных условиях. Действительно, можно было наблюдать небольшие различия между содержанием ДНК в условиях, и наименьшее количество клеток было извлечено из состояния без какого-либо фактора роста (не показано). Нормализованная активность ЩФ, однако, сильно варьировалась в зависимости от условий, с тенденцией к увеличению активности с более высокими концентрациями BMP-2 и плато при 100 нг / мл (рис. 4A, B). Самые низкие уровни активности были выявлены для состояния, содержащего 50 нг/мл FGF-2. Хотя сходные тенденции можно было наблюдать для обоих оцениваемых моментов времени, все значения значительно увеличивались с течением времени в культуре с 4-го по 7-й день. В дополнение к количественному анализу активность ALP может быть качественно визуализирована с помощью прямого окрашивания цвета на основе преобразования субстрата BCIP/NBT. Более обширное и более интенсивное фиолетовое окрашивание наблюдалось в присутствии БМП-2 по сравнению с FGF-2 (рис. 4C).
Чтобы продемонстрировать два потенциальных применения охарактеризованных остеогенных ниш, было проведено исследование чувствительности к лекарственным средствам и совместные культуры рака. Для анализа лекарственной чувствительности бевацизумаб или контрольный раствор, состоящий из разбавителя препарата бевацизумаб, добавляли в питательную среду, содержащую свежий BMP-2. На 4-й день, когда в присутствии 50 нг/мл БМП-2 формировали установленные сети, во время регулярной смены среды добавляли либо контрольный раствор, либо бевацизумаб-содержащую среду, а культуры контролировали с помощью флуоресцентной визуализации. Добавление 10 мкг/мл бевацизумаба приводило к втягиванию или абляции ранее сформированной сети, в то время как контрольное условие все еще включало обширные сети через 2 дня после смены среды (рис. 5A, B). Эти изменения также могут быть количественно оценены путем отслеживания общей длины сетей с помощью анализатора ангиогенеза для ImageJ на флуоресцентных изображениях, получаемых ежедневно (рис. 5C). Альтернативно, бевацизумаб или любое другое соединение также могут быть добавлены с начала совместной культуры для оценки их влияния на формирование сетей. В случае бевацизумаба это полностью ингибировало образование эндотелиальных сетей (не показано).
Для второго применения клетки рака молочной железы MDA-MB-231 или остеосаркомы U2OS добавляли к кокультурам 4-го дня при плотности 1,5 x 103 клеток/лунка в свежей питательной среде, содержащей 50 нг/мл BMP-2. Чтобы отличить их от меченных GFP HUVEC и немеченых hBM-MSCs, раковые клетки инкубировали с CellTrace FarRed непосредственно перед посевом в остеогенные ниши. Посевы контролировали с помощью флуоресцентной микроскопии; Вначале большинство раковых клеток локализовалось у поверхности субстрата, но через 2 дня их можно было обнаружить в непосредственной близости от слоев, содержащих сосудистые кокультуры. Таким образом, 2-й день был выбран в качестве отправной точки для покадровой микроскопии, чтобы показать динамику взаимодействия между раковыми клетками и клетками в сосудистой нише. Интересно, что клетки MDA-MB-231 можно было увидеть как приближающимися, так и удаляющимися от эндотелиальных структур и, таким образом, возможно, исследовали или реконструировали окружающую среду (рис. 5D). Используя CellTrace FarRed в качестве метки для раковых клеток, GFP в качестве метки для HUVEC и дополнительного окрашивания для F-актина, все типы клеток можно было различить с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (рис. 5E).
Рисунок 1: Простой подход к надежной генерации васкуляризированных остеогенных ниш. Сборные синтетические гидрогели с глубоким градиентом жесткости позволяют создавать 3D-культуры путем последовательного посева клеток без необходимости прямой инкапсуляции. hBM-MSCs предварительно культивируют в течение 3 дней перед добавлением GFP-экспрессирующих HUVEC. Мониторинг культур осуществляется путем получения сигналов светлого поля и GFP в продольном направлении. В определенные моменты времени ниши дополнительно оцениваются на предмет их осаждения ECM и остеогенного состояния. Активность щелочной фосфатазы оценивается с помощью прямого окрашивания цвета и извлечения клеток из ниш и проведения анализа pNPP на лизатах клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Стимуляция сосудистых сетей с помощью FGF-2 или BMP-2. (A) Изображения светлого поля и флуоресценции (GFP) были получены на 2-й, 4-й и 6-й день совместной культуры клеток, выращенных в отсутствие факторов роста или в присутствии FGF-2 или BMP-2, оба при 50 нг / мл. Масштабная линейка: 400 мкм. (B-D) Количественные параметры сетей GFP-HUVEC, визуализированные на 4-й день совместного культивирования, проанализированные с помощью анализатора ангиогенеза для ImageJ. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения. Статистический анализ проводился с помощью GraphPad Prism 9.5.1. Обычный односторонний ANOVA с тестом множественных сравнений Даннетта был выполнен с n ≥ 4; * P < 0,05; ** P < 0,01; P < 0,001. (E) Трехмерные реконструкции, полученные из конфокальных стеков (общая высота: 547,5 мкм; шаг z: 2,5 мкм) сигналов GFP и F-актина для условий стимуляции FGF-2- (верхний ряд) и BMP-2- (нижний ряд). Масштабная линейка: 300 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Индукция делокализованного распространения hBM-MSC и осаждения ECM с помощью BMP-2. (А-С) 7-дневные кокультуры, выращенные в присутствии FGF-2 или BMP-2, подвергали (A) иммунофлуоресценции или (B, C) прямому окрашиванию цветом. (A) Культуры окрашивали на F-актин и белки ECM фибронектин, ламинин, коллаген I и коллаген IV. На изображениях изображены проекции максимальной интенсивности конфокальных стеков (общая высота: 100 мкм; шаг z: 5 мкм). Масштабная линейка: 200 мкм. (B,C) Культуры окрашивали с использованием (B) Picrosirius Red и (C) Alizarin Red. В верхнем ряду изображены сшитые, сплошные обзоры изображений, полученных при 2,5-кратном увеличении (масштабная линейка: 1000 мкм), а в нижнем ряду изображено одно поле зрения, полученное при 5-кратном увеличении (масштабная линейка: 400 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Биохимическая оценка активности ЩФ, индуцированной BMP-2, путем прямого окрашивания цвета. (А, Б) Активность ЩФ определяли в клеточных лизатах культур, выращенных в отсутствие факторов роста или в присутствии BMP-2 в различных концентрациях или FGF-2 в дозе 50 нг/мл в течение (А) 4 дней или (В) 7 дней совместной культуры. Показано, что активность ALP нормализована к содержанию ДНК каждого образца лизата. Данные представлены в виде среднего ± стандартного отклонения. Статистический анализ проводился с помощью GraphPad Prism 9.5.1. Обычный односторонний ANOVA с тестом множественных сравнений Даннетта был выполнен с n = 5; P < 0,0001. (C) Прямое окрашивание активности ALP в нишах, выращенных в присутствии 50 нг/мл FGF-2 или BMP-2 в течение 7 дней совместного культивирования. Изображения с левой стороны изображают сшитые сшитые обзоры изображений, полученных при 2,5-кратном увеличении (масштабная линейка: 1000 мкм), в то время как изображения с правой стороны изображают одно поле зрения, полученное при 5-кратном увеличении (масштабная линейка: 400 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Использование остеогенных, васкуляризированных ниш в продвинутых моделях рака. (A) Сигналы GFP культур, выращенных в присутствии BMP-2, визуализировали на 4-й день совместной культуры до добавления контрольного раствора (слева) или бевацизумаба в дозе 10 мкг/мл (справа) в течение 2 дней, после чего культуры снова визуализировали (6-й день совместной культуры). Масштабная линейка: 600 мкм. (B) Изображения культур, обработанных бевацизумабом, с большим увеличением показаны в A. Масштабная линейка: 250 мкм. (C) Общая длина эндотелиальных сетей, показанная в А, была количественно определена с помощью анализатора ангиогенеза для ImageJ на основе изображений, получаемых ежедневно; n ≥ 3. (D) Клетки рака молочной железы MDA-MB-231, меченные CellTrace FarRed, были добавлены к 4-дневным кокультурам, выращенным в присутствии BMP-2, и покадровые изображения были получены, начиная с 2 дней после добавления раковых клеток. Масштабная линейка: 100 мкм. (E) Проекции максимальной интенсивности конфокальных стеков (общая высота: 70 мкм; z-шаг: 2,4 мкм) тройных кокультур, генерируемых, как описано в D , и фиксированных и окрашенных для F-актина. Слева: ниши с клетками рака молочной железы MDA-MB-231; справа: ниши с клетками остеосаркомы U2OS. Масштабные линейки для изображений слева: 200 мкм; Масштабные линейки для изображений справа: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Здесь мы описываем протокол для создания in vitro модели высоковаскуляризированных ниш кости и костного мозга в полностью синтетической и контролируемой матрице на основе 3D PEG, которая имеет множество применений в исследованиях биологии костей и костного мозга, тканевой инженерии и исследованиях рака. Эта модель основана на синтетическом гидрогеле на основе ПЭГ, который функционализирован пептидами RGD и участками расщепления MMP и отлит с углубленным градиентом плотности на 96-луночных пластинах30 для визуализации со стеклянным дном. Было показано, что эта платформа plug-and-play позволяет создавать тесно взаимосвязанные 3D-сотовые сети без необходимости инкапсуляции клеток в гидрогель. Подобно ранее описанному протоколу инкапсуляции клеток, в этой работе мы показываем ремоделирование субстрата с помощью присущего клетке ECM28 для создания микроокружения, специфичного для клеточного типа. Таким образом, с помощью этого метода скрининговые анализы лекарств и анализы с высоким содержанием могут быть легко выполнены в высоковоспроизводимых органотипических условиях 3D-культивирования. 96-луночные пластины со стеклянным дном и оптически прозрачные гидрогели делают платформу совместимой с автоматизацией работы с жидкостями и высокопроизводительной микроскопией.
Первым шагом в создании остеогенной сосудистой ниши костного мозга является предварительное культивирование hBM-МСК на гидрогеле ПЭГ в течение не менее 3 дней. За это время они прикрепляются к гидрогелю, проникают в него и начинают устанавливать межклеточные контакты и осаждение ECM. Перед посевом hBM-MSC буфер хранения должен быть удален. Поскольку гидрогель находится внутри внутреннего отверстия в стандартной лунке 96-луночной пластины для визуализации, можно безопасно вставлять аспирационный наконечник вдоль боковой стороны лунки до тех пор, пока он не коснется внутреннего кольца лунки. Вакуумный насос можно использовать для аспирации, если он установлен на минимально возможную силу всасывания. В качестве альтернативы для аспирации буфера из гидрогелевой пластины можно использовать автоматическую пластинчатую мойку с высотой сопла, отрегулированной, по меньшей мере, на 0,8 мм над внутренним колодезным кольцом. Использование автоматизации для работы с жидкостями может свести к минимуму повреждение поверхности гидрогеля и привести к более высокой воспроизводимости получаемых культур. Небольшие дефекты на поверхности гидрогеля становятся видимыми, как только клетки оседают на гидрогеле и появляются на более низкой плоскости фокуса в дефектных областях гидрогеля. Таким образом, получение эталонных изображений в день 0 служит хорошим контролем качества однородности засева клеток и целостности поверхности гидрогеля. В то время как небольшие дефекты поверхности гидрогеля не препятствуют дальнейшему использованию лунки, клетки имеют тенденцию группироваться на дефектных участках и могут превращаться в нерепрезентативные узоры или быстрее достигать нижнего стекла, где они превращаются в монослой. Эти артефакты должны быть отмечены при использовании/оценке этих скважин. Аналогичные соображения применимы к любым изменениям среды, выполняемым в течение всего периода анализа.
Второй этап протокола включает добавление GFP-HUVEC к предварительно сформированной монокультуре hBM-MSC (день 0 совместной культуры). ECM, депонированный hBM-MSC, обеспечивает отличный каркас для роста эндотелиальных клеток, которые в этой работе, даже в присутствии среды, кондиционированной hBM-MSC, могли образовывать только круглые клеточные кластеры на гидрогелях (не показаны). При посеве на культуры hBM-MSC HUVEC интегрируются и образуют микрососудоподобные структуры, сравнимые с теми, которые наблюдаются в кокультурах, полученных путем инкапсуляции клеток27,28. Как правило, хорошо развитые 3D-микрососудистые сети образуются в течение 4 дней после совместного культивирования, и это можно продольно контролировать с помощью GFP-меченных HUVEC. Эти структуры могут поддерживаться в течение не менее 7 дней в культуре, что означает, что есть достаточно времени, чтобы следить за изменениями в организации сосудистой сети в ответ на лечение, например, для скрининга антиангиогенных препаратов. Морфологические элементы эндотелиальной сети могут быть количественно определены в пакетном режиме путем сегментации изображений GFP с использованием хорошо зарекомендовавших себя инструментов, таких как плагин Angiogenesis Analyzer ImageJ33, и их параметры могут быть использованы для оценки, например, эффективности лекарственного средства и фармакодинамики.
Одним из существенных преимуществ описанной клеточной модели для многих потенциальных применений является ее пластичность. Простое дополнение питательной среды различными факторами роста может изменить внешний вид совместной культуры. Например, присутствие BMP-2 на протяжении всего периода моно- и кокультуры создает остеогенную сосудистую нишу, демонстрирующую повышенную активность ЩФ, внеклеточное отложение кальция, а также сборку и осаждение ECM. Напротив, в присутствии FGF-2 остеогенные маркеры отсутствуют, и кокультура образует меньше латеральных клеточных ассоциаций, но показывает более выраженный рост 3D-клеток. Тот факт, что FGF-2 подавляет активность ЩФ, в то время как БМП-2 вызывает более сильную активность ЩФ по сравнению с отсутствием лечения фактором роста, согласуется с предыдущими наблюдениями27. Тем не менее, несмотря на эти большие различия в стромальном компоненте hBM-MSC, протяженность микрососудистой сети была очень похожа для двух состояний, обработанных фактором роста в этой работе. В контрольных культурах образовалось лишь несколько коротких сосудистых сетей, представляющих, возможно, плохо васкуляризированную нишу костного мозга. Это говорит о том, что, просто изменив тип, концентрацию и время добавления факторов роста в культуральную среду, можно получить ряд четко определенных васкуляризированных ниш костного мозга, которые потребуются для сравнительных исследований. Однако для обеспечения воспроизводимых результатов важно отметить, что прогрессирование и морфология культуры могут варьироваться в зависимости от истории используемых клеток (например, номера прохода и метода отслойки, используемого во время рутинного поддержания культуры), и рекомендуется контролировать такие факторы во время дизайна анализа.
Здесь, в качестве первого применения этой модели, мы демонстрируем чувствительность сконструированных микрососудистых сетей к лечению бевацизумабом 10 мкг/мл. Примечательно, что важно подтвердить, что используемый алгоритм может точно распознавать эндотелиальную сеть, поскольку артефакты часто генерируются на изображениях со слабо развитыми сетями. В этом случае параметры, используемые для обработки изображений (до и во время сегментации), должны быть точно настроены, часто методом проб и ошибок.
В качестве второго приложения мы представляем продвинутую модель совместной культуры, образованную последовательным посевом мезенхимальных, эндотелиальных и раковых клеток. Эта модель позволяет изучать взаимодействия между раковыми клетками, стромой и сосудистой сетью костного мозга, которые могут быть важными факторами во время метастазирования. Кроме того, эта модель может быть использована для скрининга лекарств и тестирования соединений с мишенями, выходящими за рамки ангиогенеза.
В 2D-культурах клетки не получают физиологических сигналов микросреды, не приобретают естественную клеточную морфологию и, следовательно, дифференцируются по-разному по сравнению с клетками в нативных3D-средах 35. При выращивании в инженерных 3D-гидрогелях клетки на ранней стадии депонируют врожденный ECM, который обеспечивает места адгезии и может быть активно реконструирован28,36. Здесь, чтобы создать упрощенную 3D-модель для скрининговых приложений, сосудообразующие клетки были высажены на поверхность инженерных гидрогелей и позволили создать сосудистые сети при отсутствии перфузии. Оценки на основе визуализации проводились на 2D-проекциях эндотелиальных клеток, вносящих вклад в сосудистые структуры. Однако только конфокальные изображения выявили менее выраженное врастание 3D-сосудистых сетей в образцах, стимулированных BMP-2, по сравнению с образцами, стимулированными FGF-2. Это говорит о том, что длина сформированных сосудистых структур была недооценена, в то время как их связность была завышена. Кроме того, взаимодействие между периваскулярными и эндотелиальными клетками и образованием сосудистого просвета не исследовалось. Эти аспекты, особенно с точки зрения ответных мер по лечению наркомании, потребуют дальнейшего внимания. Наконец, было бы желательно усовершенствовать протоколы, позволяющие сначала создавать обширные 3D-сосудистые сети и только затем индуцировать их остеогенную дифференцировку для создания более физиологических моделей костей и костного мозга.
В целом, представленная здесь модель очень универсальна и может быть легко адаптирована к конкретным приложениям. Например, можно использовать мезенхимальные и эндотелиальные клетки из разных источников. Известно, что МСК жировой ткани и МСК пуповины экспрессируют различные ангиогенные факторы по сравнению с БМ-МСК, и они могут быть легко замещены в качестве альтернативного стромального компонента37. Эндотелиальные клетки, выделенные из уже определенных ниш костного мозга, также могут быть использованы вместо HUVEC. Можно также установить совместную культуру с полученными от пациента, соответствующими мезенхимальными и эндотелиальными клетками костного мозга для применения в персонализированной медицине, как недавно было предложено для васкуляризированных мышечных кокультур38. Кроме того, конструкция гидрогелевой пластины позволяет проводить продольный мониторинг культуры как с помощью светлопольной, так и с флуоресцентной микроскопии, что дает пользователю возможность сократить или продлить время культивирования в зависимости от применения. В качестве альтернативы, плотность клеток, используемых для посева, может быть соответствующим образом скорректирована для ускорения или задержки формирования клеточной сети, если требуется более короткое или более длительное время наблюдения, чем указано в этом протоколе. В любом случае, необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать разрастания клеток в листовидные структуры, что может привести к сокращению гидрогеля и, в конечном итоге, к отслоению клеток.
Наконец, с использованием этой модели можно проводить широкий спектр анализов. В дополнение к иммунофлуоресценции и микроскопии, выполняемым в живых или фиксированных культурах, 3D-культуры могут быть ферментативно переварены, а клетки могут быть извлечены и подвергнуты любому типу биохимического анализа. Здесь мы демонстрируем определение активности ALP и количественное определение содержания ДНК в лизатах клеток с помощью колориметрических/флуорометрических анализов, но система совместима со многими другими методами, включая ПЦР, РНК-секвенирование и протеомику. Если чувствительность желаемого анализа не очень высока, можно объединить образцы из более чем одной лунки, чтобы увеличить количество образца, доступного для анализа. Если желаемое применение требует более быстрого растворения геля, орбитальное встряхивание пластины может быть применено в сочетании с меньшими объемами пищеварительного раствора для обеспечения образования вихрей в лунках, предполагая, что все лунки на пластине будут использоваться таким образом (живые культуры чувствительны к такому жесткому обращению). Таким образом, мы представляем здесь протокол, который, если он используется, как описано, гарантирует создание модели in vitro , которая повторяет ключевые аспекты остеогенных сосудистых ниш, но также достаточно универсальна, чтобы ее можно было модифицировать для индивидуальных применений.
Авторы хотели бы поблагодарить Риккардо Урбана за техническую помощь с устройствами для обработки жидкостей и Роди Одабаси за поддержку в проведении эпифлуоресцентной микроскопии. Эта работа финансировалась Швейцарским национальным научным фондом (гранты No 310030E_202429 и 205321__204318) и Ectica Technologies AG.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
2 mL microtubes | Eppendorf | 30120094 | |
2-Amino-2-methyl-1-propanol | Sigma | A9199 | |
3DProSeed hydrogel well plate | Ectica Technologies | ECT.PS1.001.096 | |
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma | 71768 | |
Alizarin Red S | Sigma | A5533 | |
Anti-Collagen IV antibody | Abcam | ab6311 | |
Anti-Laminin 1+2 antibody | Abcam | ab7463 | |
Automated plate washer | Agilent Biotek | ELχ50 | |
Automated washer/dispenser | Agilent Biotek | MULTIFLO FX equipped with a peristaltic pump 5uL cassette | |
Bevacizumab | Evidentic | ID PS-E07-2019-00119 A009 | |
BMP-2 | Peprotech | 120-02C | |
BSA | AppliChem | A1391 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5415 R | To centrifuge 2 mL tubes at 16100 x g during ALP analysis |
Confocal laser scanning microscope | Leica | Stellaris 5 | |
Conical 50 mL centrifuge tubes | TPP | 91050 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
DyLight 649 Donkey anti-rabbit IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 406406 | |
DyLight 649 Goat anti-mouse IgG (minimal x-reactivity) Antibody | Biolegend | 405312 | |
EGM-2 | Lonza | CC-3162 | |
Epifluorescence microscope | Leica | DMI6000B | |
FBS | Gibco | 10500-064 | |
FGF-2 | Peprotech | 100-18B | |
Fibronectin (IST-9) | Santa Cruz | sc-59826 | |
GFP-HUVECs | PELOBiotech | PB-CAP-0001GFP | |
hBM-MSCs | - | - | Isolated at University Hospital Basel; Papadimitropoulos A, Piccinini E, Brachat S, et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells from fresh bone marrow in a 3D scaffold-based system under direct perfusion. PLoS One. 2014;9(7):e102359 |
Inverted microscope | Zeiss | 200M | |
Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
MDA-MB-231 breast cancer cell line | - | Kindly obtained from J Massagué at the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | |
MEMα | Gibco | 22571-038 | |
Multimode imaging reader | Agilent Biotek | Cytation 1 | For automated imaging |
Multimode imaging reader - fluorescence and absorbance | Agilent Biotek | Cytation 5 | For measuring absorbance and fluorescence intensity duing ALP analysis |
Paraformaldehyde | Artechemis | US 040 | |
PBS | Gibco | 10010-015 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Phalloidin-rhodamine | Invitrogen | R415 | |
Picro-Sirius Red Solution | Abcam | ab246832 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit | ThermoFisher Scientific | P7589 | |
Recombinant Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab260043 | |
SIGMAFAST BCIP/NBT | Sigma | B5655-25TAB | |
Sodium hydroxide | Sigma | 1064981000 | |
Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Sigma | S-0876 | |
Sodium phosphate monobasic, monohydrate | Merck | 1.06346 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Tween20 | AppliChem | A4974 | |
U2OS osteosarcoma cell line | - | Kindly obtained from J Snedeker at the Institute for Biomechanics, Zurich | |
α-trehalose dihydrate | Sigma | 90208 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved