Criblage des canaux ioniques dans les cellules cancéreuses

Summary

Le ciblage pharmacologique des canaux ioniques est une approche prometteuse pour le traitement des tumeurs solides. Des protocoles détaillés sont fournis pour caractériser la fonction des canaux ioniques dans les cellules cancéreuses et tester les effets des modulateurs des canaux ioniques sur la viabilité du cancer.

Abstract

Les canaux ioniques sont essentiels au développement cellulaire et au maintien de l’homéostasie cellulaire. La perturbation de la fonction des canaux ioniques contribue au développement d’un large éventail de troubles ou de canalopathies. Les cellules cancéreuses utilisent des canaux ioniques pour conduire leur propre développement, ainsi que pour s’améliorer en tant que tumeur et pour s’assimiler dans un microenvironnement qui comprend diverses cellules non cancéreuses. En outre, l’augmentation des niveaux de facteurs de croissance et d’hormones dans le microenvironnement tumoral peut entraîner une expression améliorée des canaux ioniques, ce qui contribue à la prolifération et à la survie des cellules cancéreuses. Ainsi, le ciblage pharmacologique des canaux ioniques est potentiellement une approche prometteuse pour traiter les tumeurs malignes solides, y compris les cancers primitifs et métastatiques du cerveau. Ici, des protocoles pour caractériser la fonction des canaux ioniques dans les cellules cancéreuses et des approches pour analyser les modulateurs des canaux ioniques afin de déterminer leur impact sur la viabilité du cancer sont décrits. Il s’agit notamment de colorer une cellule (s) pour un canal ionique, de tester l’état polarisé des mitochondries, d’établir la fonction du canal ionique à l’aide de l’électrophysiologie et d’effectuer des tests de viabilité pour évaluer la puissance du médicament.

Introduction

Les protéines de transport membranaire sont essentielles à la communication entre les cellules, ainsi qu’au maintien de l’homéostasie cellulaire. Parmi les protéines de transport membranaire, les canaux ioniques servent à stimuler la croissance et le développement des cellules et à maintenir l’état des cellules dans des environnements difficiles et changeants. Il a également été rapporté que les canaux ioniques conduisent et soutiennent le développement de tumeurs solides, à la fois systémiques et dans le système nerveux central (SNC)^1,2. Par exemple, les canaux KCa3.1 sont responsables de la régulation du pot....

Protocol

1. Canaux ioniques immunomarqueurs dans les cellules en culture

1. Préparation des cellules et mise en place expérimentale
   1. Maintenir les cellules en culture en croissance active dans des flacons de culture de 75 cm² . Passez les cellules une fois jusqu’à ce qu’elles deviennent confluentes à 50%-90%, en fonction du temps de doublement de la lignée cellulaire utilisée.
      REMARQUE : Pour la présente étude, des cellules D283, une lignée cellulaire de médulloblastome du groupe 3, ont été utilisées.
   2. Recueillir les cellules du ballon de culture dans un tube à centrifuger (15 mL ou 50 mL) et ajouter 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % pour déta....

Discussion

Les changements dans la fonction du canal ionique modifient les cascades de signalisation intracellulaires, ce qui peut avoir un impact sur le fonctionnement global d’une cellule. Au cours de la dernière décennie, il est devenu de plus en plus clair que les canaux ioniques sont importants pour la croissance des cellules cancéreuses et les métastases. Il est important de noter que de nombreux canaux ioniques sont des cibles principales pour les traitements approuvés ciblant un large éventail de troubles

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABS SpectraMax Plate Reader	Molecular Devices	ABS
Accutase	Invitrogen	00-4555-56
Alexa Flor 488	Invitrogen	A32723	Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	100x
B27 Supplement	Gibco	12587-010	Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet	LABCONCO	302381101	Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1606-100
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13-998-211	Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C7902	Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm	Fisher Scientific	12-600-004	Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2	Fisher Scientific	430641U	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well	Fisher Scientific	353046	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well	Fisher Scientific	353072	Cell culture treated
Centrifuge	Eppendorf	EP-5804R	Refrigerated
Corning CoolCell	Fisher Scientific	07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-553-450	Corning brand
D283 Med	ATCC	HTB-185
DABCO Mounting Media	EMS	17989-97
D-Glucose	Sigma Life Sciences	D9434
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D2650	Cell culture grade
DMEM/F12, base media	Fisher Scientific	11330-032	With phenol red
DMEM/F12, phenol red free	Fisher Scientific	21041-025
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Epidermal Growth Factor	STEMCELL	78006.1
FCCP	Abcam	AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic	Millipore	GF003
GARBA5 Antibody	Aviva	ARP30687_P050	Rabbit Polyclonal
Glutamax	Gibco	35050-061
Glycerol Mounting Medium	EMS	17989-60	With DAPI+DABCO
Hemocytometer	Millipore Sigma
Heparin	STEMCELL	7980
HEPES	HyClone	SH3023701	Solution
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	Solid
ImageJ	Open platform		With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI	EMS	17989-97
KRM-II-08			experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X	Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor	Novus	N276314100U
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M9272	Hexahydrate
Microscope, Confocal	Leica	SP8
Microscope, Light	VWR	76382-982	DMiL Inverted
MTS - Promega One Step	Promega	G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL	Eppendorf	Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL	Eppendorf	Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL	Eppendorf	Z683957
Nest-O-Patch	Heka
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888022	Without vitamin A
Neurobasal-A Medium	Gibco	12348-017	Phenol red free
Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140-050
NOR-QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm	Fisher Scientific	50-998-944	4 inch width
Paraformaldehyde	EMS	RT-15710
PATHCHMASTER	Heka
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Perfusion System	Nanion	4000120
PFA	EMS	RT-15710
Phosphate Bufered Saline	Fisher Scientific	AAJ75889K2	Reagent grade
Poly-D-Lysine	Fisher Scientific	A3890401
Poly-L-Lysine	Sigma Life Sciences	P4707
Port-a-Patch	Nanion	21000072
Potassium Chloride	Sigma Life Sciences	P5405
Primary Antibody	Invitrogen	MA5-34653	Rabbit Monoclonal
Prism	GraphPad
Propofol	Fisher Scientific	NC0758676	1 mL ampule
QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs	VWR	89094-664	Sterile
Slides, 75 x 25 mm	Fisher Scientific	12-544-7	Frosted one side
Sodium Bicarbonate	Corning	25-035-Cl
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-3
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070
Synth-a-Freeze Medium	Gibco	R00550	Cryopreservation
TMRE	Fisher Scientific	50-196-4741	Reagent
TMRE Kit	Abcam	AB113852	Kit
Triton X-100	Sigma Aldrich	NC0704309
Trypan Blue	Gibco	15-250-061	Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA	Gibco	25200-072	Solution, 0.25%
Vortex Mixer	VWR	97043-562
Whatman Filter Paper	Fisher Scientific	09-927-841