틈새 및 줄기 세포 정지를 재현하기 위한 쥐 골격근의 분획되지 않은 대량 배양

요약

골격근은 상주 줄기세포를 포함한 여러 세포 유형으로 구성되어 있으며, 각 세포 유형은 근육 항상성과 재생에 특별한 기여를 합니다. 여기에서는 근육 줄기 세포의 2D 배양과 생리학적, in vivo 및 환경적 특성의 많은 부분을 보존하는 ex vivo 환경에서의 근육 세포 틈새에 대해 설명합니다.

초록

골격근은 신체에서 가장 큰 조직이며 운동에서 체온 조절에 이르기까지 다양한 기능을 수행합니다. 그 기능과 부상으로부터의 회복은 다양한 세포 유형과 핵심 근육 세포(근섬유, 근육 줄기 세포)와 틈새 사이의 분자 신호에 달려 있습니다. 대부분의 실험 환경은 이 복잡한 생리학적 미세환경을 보존하지 않으며, 근육 줄기 세포에 중요한 세포 상태인 정지 상태의 생체 외 연구도 허용하지 않습니다. 여기에서는 틈새 시장의 세포 성분을 가진 근육 줄기 세포의 생체 외 배양을 위한 프로토콜이 요약되어 있습니다. 근육의 기계적 및 효소적 분해를 통해 세포 유형의 혼합물을 얻어 2D 배양에 넣습니다. 면역염색은 1주일 이내에 여러 틈새 세포가 근섬유와 함께 배양에 존재하며, 중요하게는 정지된 근육 줄기 세포의 특성을 나타내는 Pax7 양성 세포가 존재한다는 것을 보여줍니다. 이러한 고유한 특성으로 인해 이 프로토콜은 세포 증폭 및 근본적이고 중개 문제를 해결하는 데 사용할 수 있는 정지 유사 줄기 세포 생성을 위한 강력한 도구입니다.

서문

운동, 호흡, 신진대사, 자세 및 체온 유지는 모두 골격근에 의존하며, 골격근의 오작동은 쇠약해지는 병리학(예: 근육병증, 근이영양증 등)을 유발할 수 있습니다. ¹. 골격근은 본질적인 기능과 풍부함을 감안할 때 정상적인 근육 기능을 지원하고 치료 표적이 될 수 있는 주요 측면을 이해하기 위해 노력하는 전 세계 연구 실험실의 관심을 끌었습니다. 또한, 골격근은 재생과 줄기세포 기능을 연구하는 데 널리 사용되는 모델인데, 건강한 근육은 주로 줄기세포에 의해 완전한 손상과 퇴화 후 완전히 자가 회복할 수 있기 때문이다²; 이들은 위성 세포라고도 불리며, 근육 섬유의 주변부에 있는 기저층(basal lamina) 아래에 국한되어 있다³.

성인 골격근의 핵심 세포는 근섬유(긴 세포융합 다핵 세포)와 위성 세포(근육 생성 전위가 있는 줄기 세포로 부상으로 활성화될 때까지 정지 상태)입니다. 후자의 세포는 근육 재생의 중심 세포이며,이 과정은 부재 할 때 발생할 수 없습니다 4,5,6,7.

프로토콜

모든 실험은 Institut Mondor de Recherche Biomédicale (INSERM U955)의 프랑스 및 EU 동물 규정, 특히 지침 2010/63/UE를 준수했습니다. 동물은 인증 번호 A94 028 379 및 D94-028-028로 동물 시설에서 통제되고 풍부한 환경에서 사육되었습니다. 그들은 공인된 연구원과 동물 관리인에 의해서만 취급되었으며, 동물 사육 담당자는 일생 동안 불편함의 징후가 있는지 육안으로 검사했습니다. 그들은 해부 전에 자궁 경부 탈구로 안락사되었습니다. 동물의 일생 동안 중재적 절차는 수행되지 않았습니다. 따라서 윤리 위원회와 프랑스 고등 교육, 연구 및 혁신부로부터 절차에 대한 승인을 받을 필요가 없었습니다. 실제로, 지침 2010/63/UE에 따라 안락사 및 사후 해부에 대한 윤리적 허가는 필요하지 않습니다. 이 원고에 제시된 결과는 야생형 C57BL/6NRj 라인( 재료 표 참조)과 형질전환 Tg:Pax7-nGFP 라인¹²(우리 팀에서 육종)에서 얻은 것입니다. 프로토콜은 생후 8-12주 된 수컷 및 암컷 마우스에 적용되었습니다.

1. 시약 및 장비 준비 사전 소화

결과

이 프로토콜은 내인성 틈새에서 위성 세포와 대부분의 세포를 보존하면서 근육 세포 배양을 허용합니다. 그림 2는 프로토콜의 주요 단계를 요약한 것이며, 해부 및 분해의 필수 부분은 그림 1에 나와 있습니다. 뒷다리 근육 조직의 해부가 권장되는데(그림 1A-C), 이 근육 그룹은 잘 연구되어 있고 발달 기원...

토론

성인의 골격근 기능은 정교하게 조율된 일련의 세포 상호 작용과 분자 신호에 의해 뒷받침됩니다. 여기에서, 생리학적 미세환경과 매우 유사한 생체외 환경에서 이러한 파라미터를 연구할 수 있는 방법이 제시된다.

몇몇 그룹은 근육 세포를 배양하기 위한 시험관 내 방법을 보고했습니다. 이러한 방법은 위성 세포를 분리하여 근육 전구 세포의 특성을 연구하는 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-CD31	BD	550274	dilution 1:100
anti-FOSB	Santa Cruz	sc-7203	dilution 1:200
anti-GFP	Abcam	ab13970	dilution 1:1000
anti-Ki67	Abcam	ab16667	dilution 1:1000
anti-MyHC	DSHB	MF20-c	dilution 1:400
anti-MYOD	Active Motif	39991	dilution 1:200
anti-MYOG	Santa Cruz	sc-576	dilution 1:150
anti-Pax7	Santa Cruz	sc-81648	dilution 1:100
anti-PDGFRα	Invitrogen	PA5-16571	dilution 1:50
b-FGF	Peprotech	450-33	concentration 4 ng/mL
bovine serum albumin (BSA) – used for digestion	Sigma Aldrich	A7906-1006	concentration 0.2%
BSA IgG-free, protease-free – used for staining	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	concentration 5%
cell strainer 40 um	Dominique Dutscher	352340
cell strainer 70 um	Dominique Dutscher	352350
cell strainer 100 um	Dominique Dutscher	352360
Collagenase	Roche	10103586001	concentration 0.5 U/mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Euromedex	UD8050-05-A
Dispase	Roche	4942078001	concentration 3 U/mL
Dissection forceps size 5	Fine Science Tools	91150-20
Dissection forceps size 55	Fine Science Tools	11295-51
Dissection scissors (big, straight)	Fine Science Tools	9146-11	ideal for chopping
Dissection scissors (small, curved)	Fine Science Tools	15017-10
Dissection scissors (small, straight)	Fine Science Tools	14084-08
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ThermoFisher	41966-029
EdU Click-iT kit	ThermoFisher	C10340
Fetal bovine serum – option 1	Eurobio	CVF00-01
Fetal bovine serum – option 2	Gibco	10270-106
Matrigel	Corning Life Sciences	354234	coating solution
Parafilm	Dominique Dutscher	090261	flexible film
Penicillin streptomycin	Gibco	15140-122
Paraformaldehyde – option 1	PanReac AppliChem ITW Reagents	211511.1209	concentration 4%
Paraformaldeyde – option 2	ThermoFisher	28908	concentration 4%
Shaking water bath	ThermoFisher	TSSWB27
TritonX100	Sigma Aldrich	T8532-500 ML	concentration 0.5%
Wild-type mice	Janvier	C57BL/6NRj