Tuina em um modelo de rato de ombro congelado: um protocolo eficiente e reprodutível

Summary

Este estudo desenvolve um protocolo de Tuina eficiente e reprodutível para o tratamento do ombro congelado estabelecido em um modelo de rato. Esta abordagem ajudará a estudar o método de tratamento da terapia Tuina para ombros congelados.

Abstract

O ombro congelado (SF) é uma condição comum sem terapia ideal definida. A terapia com Tuina, uma técnica de medicina tradicional chinesa (MTC) usada para tratar pacientes com fibromialgia em hospitais chineses, tem demonstrado excelentes resultados, mas seus mecanismos não são totalmente compreendidos. Com base em um estudo anterior, este trabalho teve como objetivo desenvolver um protocolo de Tuina para um modelo de rato FS. Dividimos aleatoriamente 20 ratos SD em grupo controle (C; n = 5), modelo FS (M; n = 5), tratamento com Tuina modelo FS (MT; n = 5) e tratamento oral modelo FS (MO; n = 5). Este estudo utilizou o método de imobilização gessada para estabelecer o modelo de ratos FS. O efeito de Tuina e dexametasona oral sobre a amplitude de movimento (ADM) glenoumeral foi avaliado, e os achados histológicos foram avaliados. Nosso estudo mostrou que Tuina e dexametasona oral foram capazes de melhorar a ADM ativa do ombro e preservar a estrutura da cápsula, com a terapia com Tuina se mostrando mais eficaz do que a dexametasona oral. Em conclusão, o protocolo de Tuina estabelecido neste estudo foi altamente eficaz para a fibromialgia.

Introduction

O ombro congelado (SF), também conhecido como capsulite adesiva do ombro, é uma doença autolimitada caracterizada por dor no ombro e déficits de mobilidade. Acomete tipicamente pessoas entre 30 e 70 anos, com média de idade de 50 anos, e tem prevalência em torno de 5% na população chinesa¹. Relata-se que as mulheres têm uma incidência 1,6 vezes maior de fibromialgia em comparação com os homens². A prevalência de FM é maior em pessoas com diabetes, distúrbios do metabolismo glicídico e lipídico ou outras doenças relacionadas, variando entre 10% e 36%^2,3. Os tratamentos clínicos atuais da fibromialgia incluem fisioterapia, medicações esteroides e tratamentos cirúrgicos⁴.

A Tuina, uma terapia da medicina tradicional chinesa (MTC), demonstrou efetivamente aliviar a dor no ombro em pacientes com fibromialgia, melhorando sua qualidade de vida ^5,6. No entanto, os mecanismos subjacentes desse tratamento não são bem compreendidos. Assim, o uso de modelos animais para estudar os efeitos e mecanismos de Tuina no tratamento da fibromialgia é crucial.

A articulação do ombro do rato tem uma estrutura complexa semelhante à do ombro humano e é frequentemente utilizada em estudos mecanísticos do SF⁷. O modelo de FS em ratos é caracterizado por declínio da ADM glenoumeral e fibrose capsular8^. Além disso, esse modelo permite a observação da cápsula do ombro e possibilita a pesquisa anatomopatológica durante o reparo da^lesão9. Além disso, os corticosteroides orais são frequentemente utilizados como grupo controle na pesquisa do tratamento da fibromialgia¹⁰. Este estudo tem como objetivo desenvolver um protocolo de Tuina para o modelo de ratos FS e demonstra a viabilidade da realização de experimentos com animais na pesquisa de Tuina comparando a eficácia da terapia com Tuina e dexametasona oral.

Protocol

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Shandong (Número: AWE-2022-023).

1. Animais de experimentação

1. Vinte ratos machos da raça Sprague-Dawley (SD) (7 semanas de idade, 250-280 g) foram alojados em condições padrão (temperatura ambiente [TR] 20-24 °C, umidade 40%-60% e ciclo claro/escuro de 12 h/12 h).

2. Método de agrupamento

1. Agrupar os ratos SD em grupo controle (C), grupo controle modelo FS (M), grupo de tratamento Tuina modelo FS (MT) e grupo de tratamento oral modelo FS (MO), cada um composto por 5 ratos. Manter 5 ratos por gaiola (mesmo grupo).
2. Após 7 dias de aclimatação, imobilizar um ombro dos ratos dos grupos M, MT e MO usando imobilização gessada por 3 semanas para mimetizar o SF como descrito na próxima seção.
3. Administrar a terapêutica com Tuina aos ratos do grupo MT durante 2 semanas, conforme descrito na secção 4 (Figura 1).
4. Calcular a dose necessária de dexametasona para cada quilograma de ratos (0,0675 mg/dia) com base na dose de adultos (0,75 mg/dia) e na relação entre a área de superfície do corpo do rato e o humano (0,018).
5. Administrar diariamente solução de dexametasona intragástrica a ratos do grupo MO a 0,067 mg/kg/dia às 7:00 AM durante 2 semanas.
   NOTA: Use este método de agrupamento para confirmar o efeito do protocolo de Tuina neste estudo. Realizar o método de agrupamento de acordo com os propósitos experimentais em diferentes estudos.

3. Desenvolvimento do modelo FS

1. Anestesiar ratos utilizando tribromoetanol (250 mg/kg, por injeção intraperitoneal)¹¹.
   OBS: De acordo com as exigências do comitê de ética da instituição, uma solução estoque composta de tribomoetanol (10 g) e álcool terc-amílico (10 mL) foi armazenada a 4 °C.  Antes do uso, foi diluído a 2% com água destilada.
2. Aplicar ataduras embebidas em gesso no ombro direito e tórax dos ratos, mantendo o membro torácico direito a 90° de rotação interna da articulação do ombro por 3 semanas (Figura 2)¹².
   NOTA: Monitore os ratos para garantir que eles possam realizar atividades fisiológicas normais, como caminhar, comer e beber. Recorrija a bandagem de gesso se os ratos não puderem realizar atividades fisiológicas normais.
3. Confirmar o sucesso do estabelecimento do modelo de fibromialgia observando o desenvolvimento de sintomas como rigidez na articulação do ombro direito, contração do membro superior direito, atrofia muscular e claudicação em ratos¹³.

4. Método Tuina

OBS: Durante todo o procedimento, o investigador deverá utilizar equipamentos de proteção individual. Apenas um único médico Tuina profissional deve realizar todas as manipulações (Figura 3, Figura 4 e Figura 5).

1. Treinar pelo sistema de determinação de parâmetros da técnica de massagem inteligente, que inclui um mecanorreceptor e um computador (Figura 3A).
   1. Realizar manipulações nos parâmetros mecanorreceptores e de força em três direções exibidas através de software (Figura 3B).
   2. Use o dedo do polegar para realizar o método de amassamento rotatório em um movimento rotatório a uma força de 0,5 kg e uma frequência de 100-120 vezes/min (Figura 3C).
   3. Use a ponta do dedo do polegar para executar o método de prensagem de pontos a uma força de 0,5 kg (Figura 3D).
   4. Efectuar Tuina nos ratos mantendo o visor mecânico mencionado nos passos 4.1.2 e 4.1.3 durante 1 minuto.
2. Segure o rato até que ele se acalme (~2 min). Em seguida, execute a manipulação. Coloque o rato na posição decúbito lateral, mas a posição pode mudar com base em diferentes métodos de manipulação.
3. Use o dedo indicador direito e o dedo médio para pinçar o membro anterior direito do rato e flexioná-lo e estendê-lo várias vezes para determinar as posições da articulação do ombro, do cotovelo e do úmero do rato.
4. Amasse o ombro direito, o membro anterior e o dorso do rato por rotação no sentido horário com a polpa do polegar na força de 0,5 kg e frequência de 100-120 vezes/min por 3 min (Figura 4A-C).
   1. Manipular os músculos dos membros torácicos em decúbito lateral.
   2. Manipular os músculos do ombro e das costas na posição prona.
5. Prensar o acuponto LI15 (Jianyu), SI11 (Tianzong), HT01 (Jiquan,) e LI11 (Quchi) verticalmente com a ponta do dedo do polegar 30 vezes por acuponto na força de 0,5 kg (Figura 4D-G).
   1. Utilizar o atlas do acuponto do rato para definir a localização de cada acuponto (Figura 5)^14,15.
   2. Pressione LI15, localizado na depressão anteroinferior à extremidade acromial, em decúbito ventral.
   3. Pressione SI11, localizado na depressão até a fossa infraespinal no ponto médio da coluna escapular, em decúbito ventral.
   4. Pressione HT01, localizada no centro da axila, em decúbito dorsal.
   5. Pressione LI11 localizado na depressão medial ao extensor radial do carpo na extremidade lateral da prega cubital na decúbito lateral.
6. Segurar a articulação do ombro com o polegar e o dedo médio esquerdos e esticar o membro anterior nas posições de adução, abdução, extensão anterior e extensão posterior por 10 s (Figura 4H-K).
   NOTA: Este método de alongamento deve ser realizado sem resistência em ratos.
7. Pause o procedimento de Tuina se o rato ficar agitado. Acaricie o rato por 10 s para acalmá-lo e, em seguida, prossiga com o teste.
8. Realizar o procedimento diariamente por 2 semanas.

5. Mensuração da ADM glenoumeral

NOTA: É importante completar o processo de medição o mais rápido possível para evitar a degeneração do tecido da cápsula articular.

1. Remover a escápula e os dois terços proximais do úmero em bloco após o sacrifício do rato com uma dose excessiva de tribromoetanol (dose inicial 3x, por injeção intraperitoneal), expondo a borda inferior da escápula.
2. Insira uma agulha de injeção (1,2 cm x 0,45 mm) ao longo da diáfise umeral na cabeça do úmero.
3. Insira duas agulhas de injeção verticalmente nos cantos superior e inferior da escápula em espuma plástica envolvida com uma folha cirúrgica estéril.
4. Fixe um fio fino à agulha de injeção na haste umeral e puxe-a na outra extremidade com uma força de 5 g para torná-la paralela à haste umeral. Medir o ângulo entre a borda inferior da escápula e a diáfise umeral (Figura 6).
   NOTA: Para garantir resultados confiáveis, peça a um investigador separado que realize as medições.
5. Relate os dados como média ±desvio padrão (DP) usando um software de análise estatística.
   NOTA: O software SPSS (SPSS, versão 25.0) foi usado aqui.
6. Analise as diferenças entre os grupos usando a análise de variância (ANOVA) one-way.
7. Obtenha gráficos de barras usando o software apropriado.
   NOTA: O GraphPad Prism 8 foi usado aqui.
8. Avaliar a patologia da cápsula usando a coloração de H&E e Masson após a medição.

6. Preparação da seção

1. Após avaliação da ADM glenoumeral, fixar amostras inteiras em PFA a 4% por 3 dias, seguido de descalcificação em solução de EDTA (pH 7,2) por mais 2 meses.
2. Após a desidratação, cortar blocos de tecido contendo as amostras em cortes de 5 μm¹⁶.
3. Secar a fatia a 65 °C durante 60 min.
4. Decremar a fatia.
5. Mergulhe o corte em xileno I, xileno II e xileno III por 7 min, seguido por uma série descendente de etanol (etanol anidro, 5 min; etanol 95%, 2 min; etanol 80%, etanol 70%, 2 min) e, finalmente, em água ultrapura por 2 min.

7. Coloração H&E

1. Manchar os cortes com hematoxilina por 5 min, enxaguar com etanol de ácido clorídrico a 1% por 3 s e lavar com água corrente por 5 min.
2. Manchar a seção com eosina por 3 min e lavar com água da torneira.
3. Mergulhe a seção em uma série de etanol (etanol 95% I, 3 s; 95% etanol II, 3 s; etanol anidro I, 3 s, e etanol anidro II, 1 min) e, em seguida, mergulhe em uma série de xileno (xileno I, 1 min; xileno II, 1 min).
4. Coloque uma gota de selante de goma neutra em cada amostra. Sele cada amostra com um vidro de cobertura.
5. Coletar imagens em microscópio de fluorescência invertida (barra de escala = 100 μm).

8. Coloração de Masson

1. Usando uma caneta imuno-histoquímica, desenhe um círculo ao redor das seções e, em seguida, incube as seções na solução de Bouin por 2 h a 37 °C até mordente. Em seguida, lave as seções com água até que a cor amarela desapareça.
2. Trate as amostras com corante azul lápis-lazúli por 3 min e depois lave-as com água destilada.
3. Após coloração dos cortes com hematoxilina (Mayer) por 2 min, tratar os cortes por 3 s na solução ácida de diferenciação com etanol. Em seguida, lave as seções em água corrente por 10 min.
4. Manchar as seções com solução corante ponceau magenta por 10 min e posteriormente lavá-las com água.
5. Imergir as secções na solução de ácido fosfomolíbdico durante 10 minutos.
6. Adicione a solução de coloração azul de anilina às seções por 5 minutos e, em seguida, lave-as com uma solução de trabalho de ácido fraco por 2 minutos.
7. Desidratar e tornar as secções transparentes, conforme descrito no passo 7.3.
8. Coloque uma gota de agente selante de goma neutra em cada seção e cubra com um vidro de cobertura. Deixe as seções em uma coifa para secar.
9. Colete imagens conforme descrito na etapa 7.5.

Discussion

O primeiro passo crítico é a seleção do modelo. Devido à dificuldade de implementação do modelo primário de SF, a imobilização gessada e a fixação interna cirúrgica são frequentemente utilizadas para estabelecer modelos de SF^{em ratos9,12}. A restrição mais grave da mobilidade do ombro e da fibrose da cápsula foi observada no modelo de FM estabelecido por imobilização gessada por 3 semanas^12,20. Neste estudo, as taxas de sucesso do modelo FS foram excelentes, com 100% de sucesso.

O segundo passo crítico são as manipulações utilizadas neste protocolo. Três manipulações (amassamento, prensagem e alongamento) foram utilizadas neste estudo. A manipulação do amassamento de partes moles foi aplicada no ombro, escápula e braço para relaxar a musculatura. A manipulação da prensagem foi realizada aplicando-se pressão em acupontos como TI15, SI11, HT01 e LI11, que são os mais utilizados na prática clínica para FM ^5,21. LI15, SI11 e HT01 estão localizados em posições ao redor da cápsula do ombro e podem ser eficazes na melhora da ADM e da função do ombro²². O LI11 é frequentemente usado para comprometimento motor dos membros superiores e está localizado no mesmo meridiano que o LI15. Esse método de pareamento de acupontos ajuda a melhorar a eficácia do LI15²³. Após o relaxamento total, técnicas de alongamento foram utilizadas para restaurar as atividades funcionais.

O possível problema neste protocolo é que os ratos exibem intensa resistência durante Tuina, que pode ser causada pelo medo em vez de exceder a tolerância dos ratos. Neste ponto, as manipulações devem ser interrompidas até que os ratos se acalmem (acariciar por 10 s acalma os ratos). Além disso, a extensão do alongamento deve ser ajustada de acordo com os sintomas dos ratos. Inicialmente, a limitação da articulação do ombro era óbvia, e a amplitude de alongamento era pequena. Juntamente com a intervenção, a função articular do ombro dos ratos gradualmente se recuperou e a amplitude do alongamento aumentou progressivamente. O padrão é que os ratos possam aceitar o método de alongamento sem resistência. Finalmente, os ratos têm um certo grau de agressão, e Tuina requer contato prolongado com ratos, por isso é importante usar equipamentos de proteção individual.

O controle quantitativo da manipulação é o mais difícil nos experimentos de Tuina. Enquanto um simulador de manipulação de massagem pode ser usado para controlar a força e a frequência de uma única manipulação, esse método é limitado quando múltiplas manipulações e locais de tratamento estão envolvidos^24,25. Na prática clínica, Tuina é tipicamente realizada diretamente por profissionais e, neste estudo, foi difícil intervir com equipamentos médicos. Para controlar a estimulação, o sistema inteligente de determinação de parâmetros da técnica de massagem pode ser usado para padronizar o treinamento de Tuina. Após o treinamento, o pesquisador pode aplicar a mesma força em cada rato até certo ponto. A principal limitação desse protocolo é que as manipulações não podem ser completamente controladas.

A terapia TCM Tuina tem uma rica história de uso em toda a China, com vários médicos em hospitais usando diferentes combinações de locais de manipulação e tratamento. Portanto, é importante estabelecer protocolos replicáveis e eficazes tanto para experimentos animais quanto para estudos clínicos. Neste estudo, as manipulações e acupontos utilizados foram baseados em estudo prévio de nossa equipe, combinando nossa experiência clínica com as características do modelo animal de^FM21. Este estudo demonstrou a eficácia do protocolo de Tuina desenvolvido em melhorar a função articular do ombro e reduzir a fibrose capsular em ratos FS. Estes resultados fornecem uma base para investigações adicionais sobre os mecanismos subjacentes ao tratamento com Tuina. Além disso, o protocolo pode ser útil para pesquisadores interessados em explorar a eficácia de tratamentos médicos alternativos para fibromialgia.

Um estudo anterior verificou que o mecanismo de intervenção de Tuina na fibrose pode estar relacionado à regulação negativa de TGF-β e CTGF enquanto regula o balanço de MMP-1/TIMP-1, aliviando assim a produção de matriz extracelular (MEC)²⁶. O efeito de Tuina na fibrose da cápsula do ombro pode ser conseguido através da regulação de vários mecanismos. No entanto, mais pesquisas são necessárias para compreender completamente os mecanismos envolvidos nessa melhoria.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
Embedding machine	Changzhou Paisijie Medical Equipment Co., Ltd	BM450A
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Solarbio	E1171
Hematoxylin eosin (HE) staining kit	Sparkjade	EE0012
Intelligent-massage technique parameter determination system	Shanghai Dukang Intrument Equipment Co. Ltd	ZTC-
Microtome	Leica	531CM-Y43
Modified Masson Trichrome Staining Solution	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	R20381-8	Bouin 50 mL; lapis lazuli blue dye 50 mL; Hematoxylin (Mayer) 50 mL; acidic ethanol differentiation solution 50 mL; ponceau magenta dye solution 50 mL; phosphomolybdic acid solution 50 mL; aniline blue staining solution 50 mL;  weak acid 50 mL
Tribromoethanol	Macklin	T903147-5