Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Qui, presentiamo i protocolli per lavorare con Limosilactobacillus reuteri DSM20016, dettagliando la crescita, la trasformazione plasmidica, la PCR delle colonie, la misurazione della proteina reporter fluorescente e la mini-preparazione limitata del plasmide, nonché problemi comuni e risoluzione dei problemi. Questi protocolli consentono la misurazione delle proteine reporter in DSM20016, o la conferma tramite colony PCR se nessun reporter è coinvolto.

Abstract

Lactobacillus erano un genere incredibilmente grande e diversificato di batteri comprendente 261 specie, molte delle quali erano ceppi commensali con il potenziale per l'uso come telaio per sforzi biologici sintetici all'interno del tratto gastrointestinale. L'ampia variazione fenotipica e genotipica osservata all'interno del genere ha portato a una recente riclassificazione e all'introduzione di 23 nuovi generi.

A causa dell'ampiezza delle variazioni all'interno dei vecchi generi, i protocolli dimostrati in un membro potrebbero non funzionare come pubblicizzato con altri membri. La mancanza di informazioni centralizzate su come manipolare esattamente ceppi specifici ha portato a una serie di approcci ad hoc , spesso adattati da altre famiglie batteriche. Ciò può complicare le cose per i ricercatori che iniziano sul campo, che potrebbero non sapere quali informazioni si applicano o meno al ceppo scelto.

In questo articolo, miriamo a centralizzare una serie di protocolli con dimostrato successo, in particolare nella designazione del ceppo F275 di Limosilactobacillus reuteri (altri numeri di raccolta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), insieme a consigli per la risoluzione dei problemi e problemi comuni che si possono incontrare. Questi protocolli dovrebbero consentire a un ricercatore con poca o nessuna esperienza di lavoro con L. reuteri DSM20016 di trasformare un plasmide, confermare la trasformazione e misurare il feedback del sistema in un lettore di piastre tramite una proteina reporter.

Introduction

Il genere Lactobacillus è stato storicamente classificato come gram-positivo, a forma di bastoncello, non sporigeno, anaerobi facoltativi o microaerofili che scompongono gli zuccheri per produrre principalmente acido lattico1. Questi criteri sciolti hanno portato Lactobacillus ad essere, fenotipicamente e genotipicamente, un genere estremamente diversificato. Questa ampia categorizzazione ha portato alla riclassificazione del genere, introducendo 23 nuovi generi nel 20202.

Il vecchio e più ampio genere comprendeva le principali specie commensali e probiotiche generalmente con....

Protocol

1. Preparazione di L. reuteri DSM20016 cellule elettrocompetenti

NOTA: Questo si basa su un protocollo di Berthier et al.17, con velocità di centrifugazione informate da Rattanachaikunsopon et al.18.

  1. In una provetta da centrifuga da 50 ml, inoculare L. reuteri dal brodo di glicerolo in 6 ml di brodo di deMan Rogosa Sharpe (MRS). Incubare aerobicamente durante la notte a 37 °C in un incubator.......

Representative Results

Efficienza di trasformazione
L. reuteri non richiede un plasmide dcm-/dam- non metilato, come osservato per altre Lactobacillaceae19,20 (vedere Figura 1). L'elettroporazione di L. reuteri DSM20016 con 10 μL del pTRKH3_mCherry2 plasmidico da 8,5 kb (origine della replicazione di pAMβ1 theta) dovrebbe fornire efficienze di trasformazione di circa 80 unità formanti .......

Discussion

Il passo più critico per la trasformazione di L. reuteri DSM20016 è la generazione di condizioni di crescita anaerobica dopo che le trasformazioni sono state placcate; le colonie acquisite in condizioni aerobiche sono solo molto occasionali e generalmente non riescono a crescere quando inoculate nel brodo MRS. Placcare l'intero volume di recupero dovrebbe anche essere praticato per massimizzare la probabilità di crescita della colonia. Anche con queste due fasi critiche, l'efficienza della trasformazione è a.......

Acknowledgements

Apprezziamo molto i preziosi consigli forniti dal Prof. J.P. van Pijkeren (Università del Wisconsin-Madison), la cui guida sul lavoro con L. reuteri ATCC PTA 6475 ha fornito una base per i metodi qui descritti.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb Plus DNA LadderNEBN3200L
1mL Spectrophotometer cuvettesThomas Scientific1145J12
Agarose BioShopAGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)Beckman Allegra N/ANo longer in production
AnaeroGen 2.5 L SachetThermo ScientificOXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation systemVWR58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)FroggaBioTB50-500
DNA gel x6 loading dyeNEBB7024S
Electroporation cuvetteFisherbrandFB101
ErythromycinMillipore SigmaE5389-5G
Gel electroporation bath/dockVWR76314-748
Glycerol BioShopGLY001
Limosilactobacillus reuteriLeibniz Institute DSMZDSM20016Strain designation F275
LysozymeBioShopLYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)FroggaBioLMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)Qiagen27106slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein 
MRS Broth (Dehydrated)Thermo ScientificCM0359B
MutanolysinMillipore SigmaM9901-5KU
NaOH Millipore Sigma1064691000
P100 PipetteEppendorf3123000047
P1000 PipetteEppendorf3123000063
P2.5 PipetteEppendorf3123000012
P20 PipetteEppendorf3123000039
P200 PipetteEppendorf3123000055
PCR tubesFroggaBioSTF-A120S
Personal benchtop microcentrifugeGenlantisE200100
Petri dishesVWR25384-088
PTC-150 Thermal CyclerMJ ResearchN/ANo longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)Addgene27168
SPECTRONIC 200 SpectrophotometerThermo Scientific840-281700
Storage microplateFisher Scientific14-222-225
SucroseBioShopSUC507
TAE Buffer 50xThermo ScientificB49
VortexVWR58816-121No longer in production
VWR 1500E incubatorVWRN/ANo longer in production

References

  1. Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
  2. Zheng, J., et al.

Explore More Articles

BioingegneriaNumero 196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved