Metodi per l'elettroporazione e la conferma della trasformazione in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Summary

Qui, presentiamo i protocolli per lavorare con Limosilactobacillus reuteri DSM20016, dettagliando la crescita, la trasformazione plasmidica, la PCR delle colonie, la misurazione della proteina reporter fluorescente e la mini-preparazione limitata del plasmide, nonché problemi comuni e risoluzione dei problemi. Questi protocolli consentono la misurazione delle proteine reporter in DSM20016, o la conferma tramite colony PCR se nessun reporter è coinvolto.

Abstract

Lactobacillus erano un genere incredibilmente grande e diversificato di batteri comprendente 261 specie, molte delle quali erano ceppi commensali con il potenziale per l'uso come telaio per sforzi biologici sintetici all'interno del tratto gastrointestinale. L'ampia variazione fenotipica e genotipica osservata all'interno del genere ha portato a una recente riclassificazione e all'introduzione di 23 nuovi generi.

A causa dell'ampiezza delle variazioni all'interno dei vecchi generi, i protocolli dimostrati in un membro potrebbero non funzionare come pubblicizzato con altri membri. La mancanza di informazioni centralizzate su come manipolare esattamente ceppi specifici ha portato a una serie di approcci ad hoc , spesso adattati da altre famiglie batteriche. Ciò può complicare le cose per i ricercatori che iniziano sul campo, che potrebbero non sapere quali informazioni si applicano o meno al ceppo scelto.

In questo articolo, miriamo a centralizzare una serie di protocolli con dimostrato successo, in particolare nella designazione del ceppo F275 di Limosilactobacillus reuteri (altri numeri di raccolta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), insieme a consigli per la risoluzione dei problemi e problemi comuni che si possono incontrare. Questi protocolli dovrebbero consentire a un ricercatore con poca o nessuna esperienza di lavoro con L. reuteri DSM20016 di trasformare un plasmide, confermare la trasformazione e misurare il feedback del sistema in un lettore di piastre tramite una proteina reporter.

Introduction

Il genere Lactobacillus è stato storicamente classificato come gram-positivo, a forma di bastoncello, non sporigeno, anaerobi facoltativi o microaerofili che scompongono gli zuccheri per produrre principalmente acido lattico¹. Questi criteri sciolti hanno portato Lactobacillus ad essere, fenotipicamente e genotipicamente, un genere estremamente diversificato. Questa ampia categorizzazione ha portato alla riclassificazione del genere, introducendo 23 nuovi generi nel 2020².

Il vecchio e più ampio genere comprendeva le principali specie commensali e probiotiche generalmente con....

Protocol

1. Preparazione di L. reuteri DSM20016 cellule elettrocompetenti

NOTA: Questo si basa su un protocollo di Berthier et ^al.17, con velocità di centrifugazione informate da Rattanachaikunsopon et al.¹⁸.

1. In una provetta da centrifuga da 50 ml, inoculare L. reuteri dal brodo di glicerolo in 6 ml di brodo di deMan Rogosa Sharpe (MRS). Incubare aerobicamente durante la notte a 37 °C in un incubator.......

Discussion

Il passo più critico per la trasformazione di L. reuteri DSM20016 è la generazione di condizioni di crescita anaerobica dopo che le trasformazioni sono state placcate; le colonie acquisite in condizioni aerobiche sono solo molto occasionali e generalmente non riescono a crescere quando inoculate nel brodo MRS. Placcare l'intero volume di recupero dovrebbe anche essere praticato per massimizzare la probabilità di crescita della colonia. Anche con queste due fasi critiche, l'efficienza della trasformazione è a.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	No longer in production
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain designation F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	No longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	No longer in production
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	No longer in production