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Aqui, apresentamos protocolos para trabalhar com Limosilactobacillus reuteri DSM20016, detalhando crescimento, transformação plasmidial, PCR de colônias, medição de proteína repórter fluorescente e mini-preparação limitada de plasmídeos, bem como problemas comuns e solução de problemas. Esses protocolos permitem a medição de proteínas repórteres em DSM20016, ou a confirmação via PCR de colônia se nenhum repórter estiver envolvido.
Lactobacillus eram um gênero incrivelmente grande e diversificado de bactérias compreendendo 261 espécies, várias das quais eram cepas comensais com potencial para uso como chassi para empreendimentos biológicos sintéticos dentro do trato gastrointestinal. A ampla variação fenotípica e genotípica observada dentro do gênero levou a uma recente reclassificação e à introdução de 23 novos gêneros.
Devido à amplitude das variações dentro dos gêneros antigos, os protocolos demonstrados em um membro podem não funcionar como anunciado com outros membros. A falta de informações centralizadas sobre como manipular exatamente cepas específicas levou a uma série de abordagens ad hoc , muitas vezes adaptadas de outras famílias bacterianas. Isso pode complicar as coisas para os pesquisadores que estão começando na área, que podem não saber quais informações se aplicam ou não à cepa escolhida.
Neste artigo, pretendemos centralizar um conjunto de protocolos com sucesso demonstrado, especificamente na designação F275 da cepa de Limosilactobacillus reuteri (outros números de coleta: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), juntamente com conselhos de solução de problemas e problemas comuns que se podem encontrar. Esses protocolos devem permitir que um pesquisador com pouca ou nenhuma experiência trabalhando com DSM20016 de L. reuteri transforme um plasmídeo, confirme a transformação e meça o feedback do sistema em um leitor de placas por meio de uma proteína repórter.
O gênero Lactobacillus foi historicamente classificado como gram-positivo, em forma de bastonete, não formador de esporos, anaeróbios facultativos ou microaerófilos que quebram açúcares para produzir principalmente ácido lático1. Esses critérios frouxos levaram a que Lactobacillus fosse, fenotípica e genotipicamente, um gênero extremamente diverso. Essa ampla categorização resultou na reclassificação do gênero, introduzindo 23 novos gêneros em 20202.
O gênero antigo e mais amplo incluía as principais espécies comensais e probióticas geralmente consideradas seguras (GRAS) para....
1. Preparação de células eletrocompetentes DSM20016 L. reuteri
NOTA: Baseia-se em um protocolo de Berthier et al.17, com velocidades de centrifugação informadas por Rattanachaikunsopon et al.18º.
Eficiências de transformação
L. reuteri não necessita de plasmídeo dcm-/dam- não metilado, como observado para outras Lactobacillaceae19,20 (ver Figura 1). A eletroporação de DSM20016 de L. reuteri com 10 μL do pTRKH3_mCherry2 plasmidial de 8,5 kb (pAMβ1 origem da replicação) deve proporcionar eficiências de transformação de aproximadamente 80 unidade.......
A etapa mais crítica para a transformação da DSM20016 de L. reuteri é a geração de condições de crescimento anaeróbio após as transformações serem plaqueadas; colônias adquiridas em condições aeróbicas são muito ocasionais e geralmente não crescem quando inoculadas em caldo MRS. O chapeamento de todo o volume de recuperação também deve ser praticado para maximizar a probabilidade de crescimento da colônia. Mesmo com essas duas etapas críticas, a eficiência da transformação ainda é uma .......
Agradecemos imensamente os valiosos conselhos fornecidos pelo Prof. J.P. van Pijkeren (University of Wisconsin-Madison), cuja orientação sobre o trabalho com L. reuteri ATCC PTA 6475 forneceu uma base para os métodos descritos aqui.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
Agarose | BioShop | AGR001 | |
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
Glycerol | BioShop | GLY001 | |
Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
Sucrose | BioShop | SUC507 | |
TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
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