Ex Vivo Cultura de Perfusão de Grandes Vasos Sanguíneos em Biorreator Impresso em 3D

Summary

Este protocolo apresenta a instalação e operação de um biorreator impresso em 3D recentemente desenvolvido para a cultura ex vivo de vasos sanguíneos em perfusão. O sistema foi projetado para ser facilmente adotado por outros usuários, prático, acessível e adaptável a diferentes aplicações experimentais, como biologia básica e estudos farmacológicos.

Abstract

A doença vascular constitui a base da maioria das doenças cardiovasculares (DCV), que continuam sendo a principal causa de mortalidade e morbidade em todo o mundo. Intervenções cirúrgicas e farmacológicas eficazes para prevenir e tratar a doença vascular são urgentemente necessárias. Em parte, a escassez de modelos translacionais limita a compreensão dos processos celulares e moleculares envolvidos na doença vascular. Biorreatores de cultura de perfusão ex vivo fornecem uma plataforma ideal para o estudo de grandes vasos animais (incluindo humanos) em um ambiente dinâmico controlado, combinando a facilidade de cultivo in vitro e a complexidade do tecido vivo. A maioria dos biorreatores é, no entanto, de fabricação personalizada e, portanto, de difícil adoção, limitando a reprodutibilidade dos resultados. Este trabalho apresenta um sistema impresso em 3D que pode ser facilmente produzido e aplicado em qualquer laboratório biológico, e fornece um protocolo detalhado para sua configuração, possibilitando a operação dos usuários. Este inovador e reprodutível sistema de cultura de perfusão ex vivo permite o cultivo de vasos sanguíneos por até 7 dias em condições fisiológicas. Esperamos que a adoção de um biorreator de perfusão padronizado possa apoiar uma melhor compreensão dos processos fisiológicos e patológicos em grandes vasos sanguíneos de animais e acelerar a descoberta de novas terapêuticas.

Introduction

A parede vascular existe em estado estacionário reativo, o que garante tanto responsividade a estímulos externos (i.e., mudança de pressão, vasoconstritores) quanto uma superfície consistente e não ativadora, impedindo a coagulação sanguínea e a infiltração de células inflamatórias¹. Em resposta a estímulos dependentes do envelhecimento e do estilo de vida e mediante dano direto, a parede vascular ativa processos de remodelação como reestenose e aterosclerose, que são conhecidos contribuintes para doenças cardiovasculares (DCV) comuns, como acidente vascular cerebral isquêmico e infarto do miocárdio². Embora abordagens intervencionistas, como revascularização percutânea e implante de stent, estejam disponíveis para combater manifestações avançadas de doença vascular, elas são conhecidas por provocar mais danos vasculares, muitas vezes levando à recorrência. Além disso, apenas estão disponíveis soluções preventivas e em fase inicial limitadas. A compreensão dos mecanismos que mantêm a homeostase da parede vascular e impulsionam sua disfunção está no cerne do desenvolvimento de novas curas³.

Apesar do constante desenvolvimento e avanços na biologia molecular e engenharia de tecidos, os estudos em animais continuam sendo um componente crucial dos estudos de biologia vascular. Estudos in vivo em animais têm fornecido enorme insight sobre os mecanismos da homeostase e patologia vascular; no entanto, esses procedimentos são caros, têm rendimento relativamente baixo e apresentam problemas éticos substanciais. Além disso, animais de pequeno porte são pouco representativos da fisiologia vascular humana, e experimentos com animais maiores são muito mais caros e criam considerações éticas adicionais ^4,5. Com a crescente demanda por soluções farmacêuticas e médicas para uma população em rápido envelhecimento, as desvantagens do uso de animais são ampliadas, impactando a reprodutibilidade, confiabilidade e transferibilidade dos resultados para o cuidado do paciente⁶.

Os sistemas in vitro oferecem uma plataforma simplificada para o estudo de mecanismos básicos, mas não conseguem recapitular a complexidade de todo o tecido, as interações entre as células e a matriz extracelular e as forças mecânicas, que são determinantes críticos no desenvolvimento de doenças vasculares⁷.

Estudos ex vivo realizados em tecidos inteiros mantidos em ambientes artificialmente controlados mimetizam a complexidade in vivo, ao mesmo tempo em que permitem investigações de rendimento relativamente alto⁸. Dada a capacidade de controlar de perto as condições de cultivo e o ambiente, os modelos ex vivo permitem uma ampla gama de estudos complexos e fornecem uma alternativa adequada para reduzir o uso de procedimentos animais em biologia vascular. As culturas estáticas dos anéis vasculares ofereceram informações interessantes, mas falharam em incorporar o elemento hemodinâmico crucial⁹. De fato, o estudo do sistema vascular ex vivo apresenta desafios específicos relacionados às muitas forças dinâmicas que se aplicam às células dentro da parede dos vasos sanguíneos. Estímulos como fluxo luminal, turbulência, tensão de cisalhamento, pressão e deformação da parede afetam significativamente a fisiopatologia tecidual^10,11,12.

Os biorreatores de perfusão são essenciais para o estudo da homeostase e remodelamento vascular em resposta a lesões ou alterações hemodinâmicas¹³. Além disso, a cultura de perfusão pode ser utilizada para melhorar a maturação e a durabilidade dos vasos sanguíneos manipulados por tecidos (TEBVs), fornecendo alternativas adequadas para enxertos vasculares¹⁴.

Os biorreatores de perfusão comercialmente disponíveis são limitados em flexibilidade e adaptabilidade e são dispendiosos. Muitos dos biorreatores desenvolvidos internamente são difíceis de replicar em outros laboratórios, devido às descrições limitadas e à indisponibilidade de componentes especialmente fabricados 7,8,9,10,11,12. Para superar essas limitações, desenvolvemos recentemente um novo biorreator (EasyFlow), que é econômico de produzir, acomoda uma variedade de tecidos e permite modificações relativamente simples para se adaptar a diferentes demandas de pesquisa¹³. A pastilha é impressa em 3D e se encaixa como em uma tampa de um tubo de centrífuga padrão de 50 mL. Seu design modular e fabricação de impressão 3D o tornam acessível e reprodutível em diferentes laboratórios, bem como facilmente modificável para se adaptar a diferentes necessidades científicas. Este protocolo descreve a montagem e operação básica do sistema de biorreator em ambiente de perfusão arterial.

Protocol

Este protocolo descreve a montagem e utilização de um sistema composto por duas pastilhas EasyFlow (biorreator): uma representando a câmara de reação (C), contendo a amostra da artéria perfundida, e outra funcionando como reservatório médio (R) (Figura 1 e Figura 2A). As artérias carótidas foram obtidas de leitões machos e fêmeas (6-12 kg) com 4-6 semanas de idade no The Pirbright Institute, Reino Unido. Os procedimentos com animais foram realizados de acordo com o Home Office Animals (Scientific Procedures) Act (1986) (ASPA) e aprovados pelo Animal Welfare and Ethical Review Board (AWERB) do The Pirbright Institute. Os animais foram alojados de acordo com o Código de Práticas para o Alojamento e Cuidados com os Animais Criados. Todos os procedimentos foram conduzidos por titulares de Licença Pessoal treinados e competentes sob a Licença de Projeto PPL70/8852. Os leitões foram abatidos de acordo com o método do esquema um, sob o ASPA.

1. Fabricação de pastilhas

1. Fabricar a pastilha por impressão 3D, utilizando o modelo 3D fornecido (Arquivo Suplementar 1).
   NOTA: A modelagem 3D permite alterações fáceis no projeto para se adaptar a novas aplicações. Materiais alternativos e técnicas alternativas de fabricação também podem ser usados para produzir a pastilha. Devido à complexa estrutura interna, a sinterização seletiva a laser e a estereolitografia são alternativas^{apropriadas 15}. A poliamida 12 (PA12; ver Tabela de Materiais) é um bom material candidato devido ao seu desempenho superior em termos de retenção de líquidos e resistência a ciclos repetidos de esterilização por calor¹⁶.
2. Fabricar as juntas de silicone e as arruelas de policarbonato por corte a laser¹⁷, utilizando os desenhos fornecidos no Arquivo Suplementar 2.
   NOTA: O corte a laser é facilmente terceirizado e um método de fabricação barato. As arruelas podem ser fabricadas em aço inoxidável, proporcionando um componente mais resistente para uso repetido. Todos os outros componentes são itens disponíveis comercialmente. Uma lista completa dos materiais necessários é fornecida na Tabela 1. Os detalhes comerciais dos itens estão incluídos na Tabela de Materiais.

2. Esterilização, montagem e escorvamento de dispositivos

1. Esterilizar todos os componentes seguindo as instruções da Tabela 1.
2. Em condições de fluxo laminar, montar dois insertos fabricados (etapa 1), como mostra a Figura 1A.
3. Monte o sistema de perfusão conforme a Figura 2, seguindo os passos abaixo:
   1. Conecte duas válvulas de três vias conectadas à porta R1 do reservatório (porta de troca de mídia).
   2. Conecte a saída resultante à cabeça da bomba peristáltica usando um tubo equipado com uma válvula unidirecional (tubo de válvula unidirecional).
   3. Conecte o cabeçote da bomba à porta C4 da câmara de reação usando a tubulação do sistema equipada com uma válvula unidirecional.
      NOTA: Este ramo pode opcionalmente ser equipado com um sensor de pressão que permite a monitorização constante.
   4. Conecte a porta C1 da câmara de reação à tubulação de parede macia, e esta ao canal de resistência (pequeno diâmetro interno).
      NOTA: O comprimento da tubulação de resistência influenciará muito a pressão presente no sistema. Isso deve ser mais bem investigado para garantir condições adequadas de perfusão.
   5. Estender o canal de resistência com a tubulação do sistema, criando um canal de retorno e fechando o circuito de circulação luminal conectando-se ao reservatório em R5 (Figura 2C).
   6. Crie um canal de transbordamento conectando a câmara de reação C3 ao reservatório R3 com a tubulação do sistema.
   7. Conecte um filtro de ventilação através de R2.
   8. Crie um amortecedor de pressão conectando uma seringa contendo ar e meio à câmara de reação C6.
      NOTA: A relação ar-mídia correta dependerá do amortecimento de pressão necessário.
4. Primer o sistema com meio de perfusão (meio águia modificado de Dulbecco [DMEM] + 10% [v/v] soro fetal bovino [SFB] + 1% [v/v] penicilina-estreptomicina + 1% [v/v] anfotericina B + 30% [v/v] dextrano; ver Tabela de Materiais) através das portas de troca de meios e do reservatório.
   NOTA: O escorvamento do sistema reduz o risco de bolhas presas no sistema e identifica possíveis vazamentos. O volume recomendado de mídia é de cerca de 100-120 mL. O volume utilizado dependerá do volume morto da tubulação utilizada para experimentação.

3. Colheita e preparação das amostras

1. Coletar as artérias carótidas comuns direita e esquerda, minimizando o manuseio direto do tecido^arterial13.
2. Colocar o tecido em meios de transporte a frio (DMEM + 20% [v/v] FBS + 2% [v/v] penicilina-estreptomicina + 1% [v/v] anfotericina B, ver Tabela de Materiais) para transferência.
3. Em um gabinete de fluxo laminar, remova o excesso de tecido conjuntivo e corte as extremidades do tecido usando uma lâmina de bisturi. Lave o tecido duas vezes em meio de transporte frio.
4. Coloque o tecido em um agitador orbital em meio de transporte por pelo menos 30 min para uma lavagem completa.
5. Conectar um segmento não ramificado da artéria ao sistema do biorreator usando dois conectores luer farpados e fixá-lo no lugar usando uma ligação vascular (laços vasculares de silicone; Tabela 1).
   OBS: A ligação do vaso proporciona a tensão e a retração adequadas para fixar o vaso. A secção oval previne danos teciduais.
6. Fluir suavemente através da artéria para verificar a patência.
7. Após fixar a artéria ao inserto fabricado, preencher o espaço de reação com meios de perfusão (passo 2.4). Finalmente, preencha suavemente o circuito de circulação luminal com mídia para eliminar qualquer ar restante do sistema.
8. Conectar o espaço de reação com o sistema de perfusão previamente montado (seção 2), completando a circulação.
   NOTA: Recomenda-se realizar uma verificação de qualidade por imunohistoquímica do tecido processado. Isso identifica qualquer dano devido ao manuseio excessivo durante a preparação.

4. Cultura de perfusão e mudança de mídia

1. Colocar o sistema de perfusão numa incubadora a 37 °C com CO₂ a 5% e, em seguida, ligá-lo a uma bomba peristáltica (ver Tabela de Materiais)
2. Conecte quaisquer sistemas de aquisição adicionais (facultativos), como sensores de pressão (consulte a Tabela de Materiais).
3. Deixe o sistema se equilibrar durante a noite com uma baixa taxa de fluxo de meio de ~10-15 mL/min.
   NOTA: Experimentos iniciais para determinar as configurações da bomba, o fluxo do meio, a pressão do sistema e as configurações ideais de amortecedores/grampos de pressão são necessários para garantir que as condições apropriadas sejam atendidas.
4. No dia seguinte, aumente o fluxo incrementalmente (+1 rpm a cada hora, equivalente a um aumento de ~2,5 mL/min a cada hora, no sistema atual) até que o fluxo final (35 mL/min) seja alcançado. Monitore o sistema periodicamente em busca de vazamentos.
   NOTA: Para calcular o caudal exacto com base na velocidade peristáltica da bomba, os utilizadores devem primeiro efectuar uma calibração adequada da bomba¹⁸. Usando a fórmula (1), o fluxo volumétrico (Q) pode ser calculado com base no volume dispensado (V) dentro de um determinado tempo (t). Para calcular a velocidade de fluxo estimada () podemos utilizar a vazão (Q) previamente calculada e a área de secção transversa do vaso (A), descritas na equação (2).
   (1º)
   (2º)
5. A cada 3 dias, trocar 50% do meio (~50 mL) conectando uma seringa preenchida com meio fresco à porta de troca do meio mais próxima da bomba e uma seringa vazia ao orifício mais próximo do reservatório para coletar o meio gasto (Figura 2).
   OBS: A utilização de duas válvulas de três vias como portas de troca de meios facilita a operação contínua da perfusão durante a troca do meio.
6. Ao final do experimento, retirar o tecido da câmara de reação aparando as extremidades conectadas ao biorreator com tesoura cirúrgica estéril.
7. Desmonte, limpe e esterilize o sistema para uso posterior.

5. Análise da amostra

1. Fixar a amostra colhida em paraformaldeído (PFA) a 4% durante a noite a 4 °C.
2. Incorporar o tecido em temperatura ótima de corte (OCT; ver Tabela de Materiais)¹⁹ e congelar por imersão em iso-pentano resfriado em nitrogênio líquido.
3. Obter criosecções de 3-5 mm de espessura usando um criostato.
4. Realizar imunohistoquímica (hematoxilina e eosina [H&E]) e/ou imunofluorescência. Siga o protocolo típico de imunofluorescência:
   1. Bloquear as fatias durante 1 h à temperatura ambiente com soro de cabra a 20% [v/v] em solução salina tamponada com fosfato (PBS; ver Tabela de Materiais).
   2. Incubar as fatias durante a noite a 4 °C com anticorpo primário de coelho contra CD31 diluído 1:50 em PBS (ver Tabela de Materiais).
   3. Lave três vezes com PBS por 5 min.
   4. Incubar durante 1 h a 37 °C com anticorpo secundário de cabra anticoelho fluorescentemente marcado diluído 1:200 em PBS e anticorpo fluorescente diretamente conjugado de actina de músculo liso α (SMA) diluído 1:200 em PBS (ver Tabela de Materiais).
   5. Lave três vezes com PBS por 5 min.
   6. Corar os núcleos com DAPI diluído 1:1.000 em PBS por 10 min à temperatura ambiente.
   7. Incubar com 0,1% (p/v) de Sudan Black (ver Tabela de Materiais) em etanol a 70% (v/v) durante 10 minutos à temperatura ambiente para reduzir a autofluorescência tecidual.
   8. Lave o tecido com água deionizada abundante. Monte as corrediças no meio de montagem.
   9. Obtenha imagens das amostras com um microscópio confocal de varredura a laser.

Discussion

Os sistemas de perfusão vascular ex vivo constituem uma plataforma única para estudar a função e o comportamento das células vasculares dentro de seus tecidos nativos sob condições controladas, o que possibilita a dissecção de processos complexos como o remodelamento vascular pós-lesão22. No entanto, a maioria dos biorreatores relatados são sistemas fabricados internamente baseados em componentes feitos sob medida e muitas vezes são difíceis de replicar por outros²³. Soluções comerciais alternativas existem, mas carecem de flexibilidade no projeto e podem ser relativamente dispendiosas²⁴.

Desenvolvemos um sistema alternativo que fornece uma plataforma fácil, barata e reprodutível que pode ser fabricada usando técnicas de impressão 3D de código aberto¹³. O presente artigo descreve a configuração do sistema para habilitar aplicativos reproduzíveis por usuários finais. Essa configuração permite a aplicação de condições fisiológicas e patológicas de pressão (40-180 mmHg), vazão (6-30 mL/min) e em combinação com meios que mimetizam a viscosidade sanguínea, com graus variados de tensão de cisalhamento.

A reprodutibilidade é um aspecto essencial do processo científico, pois permite que os pesquisadores validem os achados de outros e construam sobre eles para avançar nossa compreensão das doenças vasculares. Além disso, ferramentas que possibilitem e promovam colaborações entre grupos são essenciais para o avanço do conhecimento científico. O EasyFlow representa um exemplo dessas soluções acessíveis e de código aberto que podem ser facilmente produzidas e adotadas por laboratórios que trabalham em uma ampla gama de projetos dentro do campo das ciências vasculares e além.

Relatamos que essa cultura do dispositivo mantém a viabilidade do tecido arterial por pelo menos 7 dias, podendo ser usada para modelar etapas específicas da doença vascular. Com isso, pode-se modelar as condições fisiológicas de fluxo e pressão¹³. É importante ressaltar que essa cultura de perfusão é custo-efetiva devido ao baixo custo de produção e ao baixo volume de meio necessário para operar o sistema.

O design 3D também pode ser adaptado a novas aplicações, e novos materiais para impressão podem ser testados. Mesmo em seu formato atual, o espaço de alojamento de amostras pode ser facilmente adaptado a amostras de diferentes tamanhos, alterando o comprimento dos encaixes ou o furo dos conectores luer. É importante notar que, dada a natureza modular do dispositivo e suas pequenas dimensões, este biorreator pode ser usado em vários setups (Figura 5) e pode ser aplicado em culturas multiplex, onde várias amostras podem ser expostas a diferentes condições ao mesmo tempo em biorreatores separados.

Prevê-se que o uso do sistema seja expandido no futuro para apoiar a cultura de vasos sanguíneos de diferentes origens (por exemplo, diferentes espécies) e de diferentes naturezas (por exemplo, veias, linfáticos), e talvez aplicado à cultura de outros tecidos ocos (por exemplo, traqueia, intestino). Em particular, pesquisas mostram que a cultura de arcabouços teciduais em perfusão constante auxilia na distribuição homogênea das células dentro da construção e maturação do tecido resultante^25,26. Além disso, a semeadura dos enxertos vasculares em perfusão contribui para a obtenção de uma luz vascular mais uniformemente celularizada, em comparação com os métodos^estáticos27. Por essa razão, vislumbramos que o sistema seja aplicado à engenharia de tecidos para ajudar a enfrentar os desafios atuais, permitindo o desenvolvimento futuro de substitutos sintéticos reprodutíveis dos vasos sanguíneos²⁸.

O protocolo aqui descrito apresenta alguns passos importantes críticos para o sucesso da cultura de fluxo. Estabelecer e monitorar condições adequadas de escoamento não é trivial e precisa ser realizado em cada sistema quando ele é montado pela primeira vez, para garantir que as condições de cultura sejam fisiológicas. O fluxo e a pressão foram monitorados por meio de sensores de pressão e imagens de ultrassom. Outro ponto crítico é garantir que o tecido esteja viável e intacto no início da cultura. Isso requer uma fonte fresca, manuseio cuidadoso e pode ser verificado por análise histológica. Além disso, a solução de problemas deve ser executada no início de cada experimento para identificar qualquer potencial contaminação bacteriana ou fonte de vazamento de mídia.

É importante ressaltar que o sistema de perfusão descrito, embora forneça condições fisiológicas de pressão e fluxo, é incapaz de mimetizar inteiramente os complexos padrões de onda de pressão registrados in vivo. Essa limitação é atribuível ao uso de bomba peristáltica e pode ser resolvida com o uso de equipamentos mais especializados para reproduzir condições hemodinâmicas avançadas. A cultura de vasos sanguíneos em um biorreator também é incapaz de abordar estudos em que o sistema imunológico ou a interação com outros órgãos é crítica.

Em conclusão, é apresentado um sistema de perfusão impresso em 3D simples que pode mimetizar o ambiente hemodinâmico fisiológico, o que deve contribuir para a padronização de culturas de vasos sanguíneos ex vivo . Seu potencial de customização e aplicação em cultura de longo prazo o torna uma ferramenta essencial para o avanço da compreensão desses complexos sistemas biológicos em fisiologia e condições patológicas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EasyFlow	-	-	3D printed by MultiJet Fusion by Protolabs
PA12 - 3D printing	Protolabs	-	-
Peristaltic pump	Heidolph	PD5201
Culture media components:
Amphotericin B solution, 250 mug/mL in deionized water	Sigma-Aldrich	A2942-20ML
Dextran  from Leuconostoc spp.	Sigma-Aldrich	D8802-25ML
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose, w/ 4500 mg/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	D6429-6X500ML
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F9665
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Immunostaining materials:
Cryostat	LEICA	CM3050 S
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-10MG
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023-10ML
Goat α-Rabbit Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11008
Invitrogen eBioscience Fluoromount G	Thermo Fisher Scientific	50-187-88
MX35 Premier + Microtome Blade	Thermo Scientific	3052835
Optimal Cooling Tempearure Compound - OCT	Agar Scientific	AGR1180
Rabbit α-CD31 antibody	Abcam	ab28364
Sudan Black B	Santa Cruz Biotechnology	SC-203760
X72 SuperFrost Plus Adhesion slide, 25x75x1mm, White, 90° Ground Edges, Frosted Area 20mm, 72/box	Fisher Scientific	J1800AMNZ
α-Smooth Muscle Actin (SMA) Alexa Fluor® 647-conjugated antibody	R&D Systems	IC1420R
Material for laser cutting of components:
Clear Plastic Sheet, 1250 mm x 610 mm x 1 mm (for laser cutting of  washers)	RS Components	258-6590
RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of  silicone seals)	RS Components	840-5541
Optional pressure monitors:
Pressure sensor	Parker Hannifin	080-699PSX-3P-5
SciPres Pressure Monitor	Parker Hannifin	206-200-M
Pre-sterilized single use plasticware:
0.2 um filter	Sarstedt	70.1114.210
20 mL Sterile syringe	IMS Euro	40004
50 mL Centrifuge Tube	Thermo Fisher Scientific	Sarstedt - 62.547.254
Small components:
Cable ties	-	-
Masterflex Adapter Fittings, Female Luer to Hose Barb	Cole-Parmer	WZ-30800-10	Barb Adaptor
Masterflex Polycarbonate Luer Fittings	Cole-Parmer	AU-45504-84
Nylon Miniature Check Valve	Cole-Parmer	98553-00
RS PRO Translucent Rubber Sponge Sheet, 600 mm x 600 mm x 1.5 mm (for laser cutting of  silicone seals)	RS Components	840-5541
Stainless Steel M2 Hex Nuts	RS Components	527-218
Stainless Steel M2 x 6 mm Screws	RS Components	418-7426
Stainless Steel M5 Hex Nuts	RS Components	189-585
Surgical vessel loop	Vascular Silicone Ties,International Medical Supplies	10-1003
Three-way valves	IMS Euro	91000
Surgical Equipment
Anatomical Forceps, GRAEFE, Curved, 10 cm SKU: BD-07	International Medical Supplies	SKU: BD-07
Micro Forceps, Angled, 0.3 mm, 11 cm	International Medical Supplies	SKU: BD-361
Micro Scissors Noyes, Curved, 12 cm	International Medical Supplies	SKU: FD-12
Troge Surgical Scalpels - Size 23 - Box of 100	International Medical Supplies	63114
Tubing:
Eppendorf silicone tubing (I.D.1.6 mm, O.D.4.7 mm)	Eppendorf	M0740-2396	System tubing
Masterflex PharMed BPT 3-Stop Tubing	ISMATEC	95714-48	Soft wall tubing (for clamp)
RS PRO Transparent Hose Pipe, 0.8 mm ID, Silicone	RS Components	667-8432	Resistance tubing (small inner diameter)
Tygon for food (I.D. 4.8 mm, W.T. 1.6 mm)	Heidolph	525-30027-00-0	One way valve tube
Verderflex Yellow Hose Pipe, 6.4 mm ID, Verderprene	RS Components	125-4042	Pump Tubing