Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אחד האתגרים בניתוח ניסויים מסונכרנים בסדרות זמן הוא שהניסויים נבדלים לעתים קרובות זה מזה במשך ההתאוששות מסנכרון ובתקופת מחזור התא. לפיכך, המדידות מניסויים שונים אינן ניתנות לניתוח מצטבר או להשוואה בקלות. במאמר זה אנו מתארים שיטה ליישור ניסויים כדי לאפשר השוואות ספציפיות לפאזה.

Abstract

חקירת מחזור התא תלויה לעתים קרובות בסנכרון אוכלוסיות תאים כדי למדוד פרמטרים שונים בסדרת זמן כאשר התאים חוצים את מחזור התא. עם זאת, גם בתנאים דומים, ניסויים משוכפלים מציגים הבדלים בזמן הדרוש כדי להתאושש מסנכרון ולחצות את מחזור התא, ובכך למנוע השוואות ישירות בכל נקודת זמן. הבעיה של השוואת מדידות דינמיות בין ניסויים מחריפה באוכלוסיות מוטנטיות או בתנאי גידול חלופיים המשפיעים על זמן ההתאוששות המסונכרן ו/או על תקופת מחזור התא.

פרסמנו בעבר מודל מתמטי פרמטרי בשם Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) המנטר כיצד אוכלוסיות סינכרוניות של תאים משתחררות מסנכרון ומתקדמות במחזור התא. לאחר מכן ניתן להשתמש בפרמטרים הנלמדים מהמודל כדי להמיר נקודות זמן ניסיוניות מניסויים מסונכרנים בסדרות זמן לסולם זמן מנורמל (נקודות קו חיים). במקום לייצג את הזמן שחלף בדקות מתחילת הניסוי, סולם קו החיים מייצג את ההתקדמות מסנכרון לכניסה למחזור התא ולאחר מכן דרך השלבים של מחזור התא. מכיוון שנקודות עורק החיים תואמות את הפאזה של התא הממוצע באוכלוסייה המסונכרנת, סולם זמן מנורמל זה מאפשר השוואה ישירה בין ניסויים, כולל אלה עם תקופות שונות וזמני התאוששות. יתר על כן, המודל שימש ליישור ניסויים במחזור התא בין מינים שונים (למשל, Saccharomyces cerevisiae ו - Schizosaccharomyces pombe), ובכך מאפשר השוואה ישירה של מדידות מחזור התא, אשר עשוי לחשוף דמיון והבדלים אבולוציוניים.

Introduction

מדידות סדרות זמן המבוצעות על אוכלוסיות מסונכרנות של תאים בזמן שהן מתקדמות במחזור התא היא שיטה סטנדרטית לחקר המנגנונים השולטים בהתקדמות מחזור התא 1,2,3,4,5,6,7,8 . היכולת לערוך השוואות בין ניסויים בסדרות זמן סינכרוני/שחרור חיונית להבנתנו את התהליכים הדינמיים הללו. השימוש בניסויים משוכפלים כדי לאשש ממצאים יכול להגביר את הביטחון ביכולת השחזור של המסקנות. יתר על כן, השוואות בין תנאי הסביבה, בין מוטנטים ואפיל....

Protocol

1. איסוף שלב מחזור התא ונתוני ניסוי

  1. סנכרן את התאים ביחס למחזור התא באמצעות שיטת הסנכרון הרצויה (למשל, אלוטריטה צנטריפוגלית כמתואר ב- Leman et al.18 או מעצר פרומון הזדווגות כמתואר ברוזברוק 19; הן Leman et al.18 והן Rosebrock 19 כוללים גם שיטות לשחרור מסנכרון).

Representative Results

השלבים המתוארים בפרוטוקול לעיל ובזרימת העבודה באיור 1 יושמו על חמישה ניסויים מסונכרנים בסדרות זמן של מחזור התא כדי להדגים שתי השוואות מייצגות: בין שכפולים בשיטות סינכרוניות שונות (פרומון הזדווגות ואלוטריציה צנטריפוגלית18) לבין פלטפורמות ריצוף (ריצוף RNA [RNA-seq] ?.......

Discussion

מאמר זה מציג שיטה להערכה מדויקת וכמותית יותר של נתונים מניסויים בסדרות זמן על אוכלוסיות מסונכרנות של תאים. השיטה משתמשת בפרמטרים שנלמדו מ-CLOCCS, מודל היסק בייסיאני המשתמש בנתוני פאזות של מחזור תאי קלט, כגון נתוני ניצנים ונתוני תוכן DNA ציטומטרי של זרימה, כדי לקבוע פרמטרים לכל ניסוי14.......

Acknowledgements

קמפיונה וס' האזה נתמכו על ידי מימון מהקרן הלאומית למדע (DMS-1839288) ומהמכונים הלאומיים לבריאות (5R01GM126555). בנוסף, המחברים רוצים להודות ל-Huarui Zhou (אוניברסיטת דיוק) על הערות על כתב היד ועל בדיקת בטא של הפרוטוקול. אנו מודים גם לפרנסיס מוטה (אוניברסיטת פלורידה אטלנטיק) וג'ושוע רובינסון על עזרתם בקוד Java.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2x PBSFor Fixative Solution. Described in Leman 2014.
4% formaldehydeFor Fixative Solution.
100% EthanolFor flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.
CLOCCShttps://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow CytometerFor flow cytometry protocol.
Githttps://git-scm.com/
Java 19https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
MicroscopeFor counting cells and buds.
Minicondahttps://docs.conda.io/en/latest/
Protease solutionFor flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
RNAse A solutionFor flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid StainInvitrogenS7020For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.
TrispH 7.5

References

  1. Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
  2. Schwob, E., Nasmyth, K.

Explore More Articles

JoVE196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved