A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
אחד האתגרים בניתוח ניסויים מסונכרנים בסדרות זמן הוא שהניסויים נבדלים לעתים קרובות זה מזה במשך ההתאוששות מסנכרון ובתקופת מחזור התא. לפיכך, המדידות מניסויים שונים אינן ניתנות לניתוח מצטבר או להשוואה בקלות. במאמר זה אנו מתארים שיטה ליישור ניסויים כדי לאפשר השוואות ספציפיות לפאזה.
חקירת מחזור התא תלויה לעתים קרובות בסנכרון אוכלוסיות תאים כדי למדוד פרמטרים שונים בסדרת זמן כאשר התאים חוצים את מחזור התא. עם זאת, גם בתנאים דומים, ניסויים משוכפלים מציגים הבדלים בזמן הדרוש כדי להתאושש מסנכרון ולחצות את מחזור התא, ובכך למנוע השוואות ישירות בכל נקודת זמן. הבעיה של השוואת מדידות דינמיות בין ניסויים מחריפה באוכלוסיות מוטנטיות או בתנאי גידול חלופיים המשפיעים על זמן ההתאוששות המסונכרן ו/או על תקופת מחזור התא.
פרסמנו בעבר מודל מתמטי פרמטרי בשם Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) המנטר כיצד אוכלוסיות סינכרוניות של תאים משתחררות מסנכרון ומתקדמות במחזור התא. לאחר מכן ניתן להשתמש בפרמטרים הנלמדים מהמודל כדי להמיר נקודות זמן ניסיוניות מניסויים מסונכרנים בסדרות זמן לסולם זמן מנורמל (נקודות קו חיים). במקום לייצג את הזמן שחלף בדקות מתחילת הניסוי, סולם קו החיים מייצג את ההתקדמות מסנכרון לכניסה למחזור התא ולאחר מכן דרך השלבים של מחזור התא. מכיוון שנקודות עורק החיים תואמות את הפאזה של התא הממוצע באוכלוסייה המסונכרנת, סולם זמן מנורמל זה מאפשר השוואה ישירה בין ניסויים, כולל אלה עם תקופות שונות וזמני התאוששות. יתר על כן, המודל שימש ליישור ניסויים במחזור התא בין מינים שונים (למשל, Saccharomyces cerevisiae ו - Schizosaccharomyces pombe), ובכך מאפשר השוואה ישירה של מדידות מחזור התא, אשר עשוי לחשוף דמיון והבדלים אבולוציוניים.
מדידות סדרות זמן המבוצעות על אוכלוסיות מסונכרנות של תאים בזמן שהן מתקדמות במחזור התא היא שיטה סטנדרטית לחקר המנגנונים השולטים בהתקדמות מחזור התא 1,2,3,4,5,6,7,8 . היכולת לערוך השוואות בין ניסויים בסדרות זמן סינכרוני/שחרור חיונית להבנתנו את התהליכים הדינמיים הללו. השימוש בניסויים משוכפלים כדי לאשש ממצאים יכול להגביר את הביטחון ביכולת השחזור של המסקנות. יתר על כן, השוואות בין תנאי הסביבה, בין מוטנטים ואפיל....
1. איסוף שלב מחזור התא ונתוני ניסוי
השלבים המתוארים בפרוטוקול לעיל ובזרימת העבודה באיור 1 יושמו על חמישה ניסויים מסונכרנים בסדרות זמן של מחזור התא כדי להדגים שתי השוואות מייצגות: בין שכפולים בשיטות סינכרוניות שונות (פרומון הזדווגות ואלוטריציה צנטריפוגלית18) לבין פלטפורמות ריצוף (ריצוף RNA [RNA-seq] ?.......
מאמר זה מציג שיטה להערכה מדויקת וכמותית יותר של נתונים מניסויים בסדרות זמן על אוכלוסיות מסונכרנות של תאים. השיטה משתמשת בפרמטרים שנלמדו מ-CLOCCS, מודל היסק בייסיאני המשתמש בנתוני פאזות של מחזור תאי קלט, כגון נתוני ניצנים ונתוני תוכן DNA ציטומטרי של זרימה, כדי לקבוע פרמטרים לכל ניסוי14.......
קמפיונה וס' האזה נתמכו על ידי מימון מהקרן הלאומית למדע (DMS-1839288) ומהמכונים הלאומיים לבריאות (5R01GM126555). בנוסף, המחברים רוצים להודות ל-Huarui Zhou (אוניברסיטת דיוק) על הערות על כתב היד ועל בדיקת בטא של הפרוטוקול. אנו מודים גם לפרנסיס מוטה (אוניברסיטת פלורידה אטלנטיק) וג'ושוע רובינסון על עזרתם בקוד Java.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2x PBS | For Fixative Solution. Described in Leman 2014. | ||
4% formaldehyde | For Fixative Solution. | ||
100% Ethanol | For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002. | ||
CLOCCS | https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git | ||
Flow Cytometer | For flow cytometry protocol. | ||
Git | https://git-scm.com/ | ||
Java 19 | https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 | ||
Microscope | For counting cells and buds. | ||
Miniconda | https://docs.conda.io/en/latest/ | ||
Protease solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
RNAse A solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
SYTOX Green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | For flow cytometry staining. Described in Haase 2002. |
Tris | pH 7.5 |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved