Een aangepaste op optische dichtheid gebaseerde microplaattest voor het karakteriseren van actinobacteriofaaginfectie

Summary

Een op optische dichtheid gebaseerde microplaatmethode wordt beschreven om de bacteriële groei op lange termijn te kwantificeren in aanwezigheid van bacteriofagen, geschikt voor actinomyceten en andere langzaam groeiende bacteriën. Deze methode omvat aanpassingen om verdamping en dekselcondensatie te verminderen en R-code om virusinfectiestatistieken te berekenen, inclusief het gebied onder de curve, het groeimaximum en de relatieve virulentie.

Abstract

Bacteriofagen zijn een belangrijk onderdeel van natuurlijke omgevingen en ze hebben een krachtig vermogen om bacteriële populaties te vormen. Om te begrijpen hoe individuele fagen interageren met langzaam groeiende bacteriële gastheren zoals actinomyceten, is een eenvoudige en betrouwbare methode nodig voor het kwantificeren van bacteriële groei op lange termijn in de aanwezigheid van fagen. Spectrofotometrische microplaatlezers maken herhaalde metingen met een hoge doorvoer mogelijk, maar het incuberen van een klein volume voor een langere tijd kan technische uitdagingen opleveren. Deze procedure past een standaard 96-well microplaat aan om de co-kweek van fagen en bacteriën mogelijk te maken zonder subbemonstering gedurende 96 uur, waarbij de bacteriegroei elke 8 uur wordt geregistreerd met behulp van spectrofotometrische absorptiewaarden. Deze optische dichtheidswaarden worden geanalyseerd met behulp van R om infectiestatistieken op te leveren, waaronder de procentuele groeiremming, relatieve virulentie en de Stacy-Ceballos-index. De hier beschreven methoden bieden een effectieve manier om experimenten met de microplaatgroeicurve van langere duur uit te voeren en te analyseren en omvatten wijzigingen om verdamping en condensatie van het deksel te verminderen. Deze protocollen vergemakkelijken microplaatgebaseerde testen van interacties tussen langzaam groeiende bacteriële gastheren en hun bacteriofagen.

Introduction

Bacteriofagen of fagen zijn virussen die bacteriën infecteren. Ze zijn de meest talrijke biologische entiteiten op de planeet¹, en het is algemeen aanvaard dat bacteriofagen de bacteriële evolutie en ecosysteemprocessen beïnvloeden ^2,3,4. Er bestaan verschillende methoden om bacteriofaaggastheerbereik 8 en infectiedynamiek^5,6 te beschrijven, te meten en te analyseren, waaronder op agar gebaseerde methoden zoals de dubbellaagse agarmethode⁷ en op optische dichtheid gebaseerde microplaatmethoden^8,9,10,11,12. Elke methode heeft zijn eigen voor- en nadelen. Vanwege hun efficiëntie zijn platingtests met behulp van de dubbellaagse agar-methode de "gouden standaard" voor gastheerbereiktests, maar deze methode is tijd- en arbeidsintensief⁹. Snelle microplaatmethoden, die resultaten binnen 24 uur of minder retourneren, geven uitstekende resultaten voor snelgroeiende bacteriële gastheren zoals Escherichia coli 9,10,11,12, maar zijn te kort om bacteriofaaginfectieprogressie te laten zien in langzamer groeiende bacteriële gastheren zoals actinomyceten 7,13,14,15.

Een op optische dichtheid gebaseerde microplaattest die is ontworpen voor snelgroeiende bacteriën kan niet worden uitgevoerd gedurende de meerdere dagen die nodig zijn om de infectiedynamiek in een langzaam groeiende gastheerbacterie te karakteriseren zonder dat verdamping optreedt en kunstmatig hoge bacteriële dichtheden geeft. Het verkrijgen van vergelijkbare gegevens met een hoge doorvoer over bacteriofaaginfectiedynamiek voor langzaam groeiende bacteriesoorten vereist dus gespecialiseerde technieken die zijn aangepast aan deze bacteriën.

De hier gepresenteerde microplaatmethode vermindert de verdamping, waardoor langzaam groeiende bacteriën gedurende een langere periode van 96 uur samen met een faag kunnen worden gekweekt en onderzoek naar faaginfectiedynamiek en gastheerbereik mogelijk is. Deze methode toont ook de Stacy-Ceballos-index¹⁶, een op optische dichtheid gebaseerde metriek die virulentievergelijkingen tussen ongelijksoortige gastheer-virussystemen mogelijk maakt.

Protocol

Hoewel dit protocol is geschreven voor Gordonia terrae, is het ook met succes gebruikt voor Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta en Gordonia westfalica.

1. Bereiding van bacteriën

1. Gebruik in een bioveiligheidskast goede microbiologische praktijken¹⁷ om een enkele kolonie Gordonia terrae CAG3 te enten in een steriele verbijsterde kolf van 1 L met 200 ml peptongistcalciumbouillon¹⁸ (PYCa) met 0,01 mg / ml cycloheximide (zie de tabel met materialen).
2. Incubeer de kolf bij 30 °C met schudden bij 250 rpm tot de kweek verzadigd is of gedurende 3 dagen⁷.
3. Verdun de verzadigde G. terrae-cultuur serieel in PYCa-bouillon en spreid 100 μL elk van de 10−4, 10−⁵ en 10⁻⁶ verdunningen op PYCa-platen^19,20. Koel de onverdunde verzadigde cultuur bij 4 °C.
4. Incubeer de spreidplaten omgekeerd gedurende 3 dagen bij 30 °C.
5. Identificeer na incubatie een "telbare plaat", een plaat met 20-200 kolonies. Tel het aantal kolonies op die plaat en bereken de kolonievormende eenheden per milliliter (kve/ml)^19,20.
6. Verdun de verzadigde cultuur met PYCa-bouillon tot 4,0 x 10⁶ kve/ml bacteriën.

2. Faagvoorbereiding

OPMERKING: De gerapporteerde representatieve resultaten werden verkregen met de Gordonia-faag DelRio²¹, een gematigde bacteriofaag geïsoleerd op G. terrae. Deze methoden zijn ook met succes gebruikt met andere Gordonia-fagen .

1. Begin met een geïsoleerde bacteriofaag en verdun het faagmonster serieel in faagbuffer⁷ tot een verdunning van 1 x 10⁻⁸ . Voer een dubbellaagse agarfaagtitertest⁷ uit door 0,3 ml van de verzadigde G. terrae-cultuur te infecteren met 10 μL van elke faagverdunning. Na een incubatie van 5-10 minuten op kamertemperatuur, combineert u het bacterie-faagmengsel met 3 ml PYCa-topagar en giet u op PYCa-agarplaten.
2. Incubeer de platen omgekeerd bij 30 °C gedurende 3 dagen of totdat plaques^{zich 7} vormen.
3. Identificeer na incubatie een "telbare plaat", een plaat met 20-200 plaques. Tel het aantal plaques op die plaat en bereken plaquevormende eenheden per milliliter (pfu/ml)⁷.

3. Microplaatvoorbereiding

OPMERKING: Voor deze methode moeten 96-puts microplaten met platte bodem (zie de materiaaltabel) worden gebruikt. Alle plaatvoorbereiding en -belading moeten in een bioveiligheidskast worden voltooid en er moeten goede microbiologische praktijken¹⁷worden toegepast.

1. Bereid de anti-fog dekselcoatingoplossing door 100 μL Triton-X 100, 40 ml 100% isopropanol en 160 ml gedeïoniseerd water²² te combineren. Roer om te mengen en bewaar bij kamertemperatuur.
2. Voeg in een bioveiligheidskast 6 ml dekselcoatingoplossing toe aan het binnenoppervlak van een steriel 96-well microplaatdeksel, houd het deksel bij de randen en draai het om ervoor te zorgen dat het door de oplossing wordt bedekt. Laat de oplossing 20 s op het deksel zitten, giet de oplossing eraf en keer het deksel onder een hoek om op een geautoclaveerde papieren handdoek totdat het deksel volledig droog is, wat meestal 35-45 minuten duurt. Zorg ervoor dat u het deksel bij de randen houdt.
3. Bereid 20 ml 0,1% agarose in water voor elke 96-well microplaat, microwaving om de agarose te smelten.
4. Zodra de agarose is afgekoeld tot 50-60 °C, pipet 100 μL van de 0,1% agarose in alle ruimten tussen de putjes van de plaat en 200 μL agarose in de putjes in rij A en rij H en kolom 1, kolom 2, kolom 11 en kolom 12²³ (figuur 1).

4. De plaat laden met bacteriën en faag

OPMERKING: Alle plaatvoorbereiding en -belading moeten in een bioveiligheidskast worden voltooid en er moeten goede microbiologische praktijken¹⁷ worden toegepast.

1. De 96-well plaat bevat 75 μL van 2,0 x 10⁶ kve / ml bacteriën in elke put⁹. Verdun de 4,0 x 10 6 kve/ml bacteriecultuur 1:1 met 2x PYCa bouillon tot 2,0 x 10⁶ kve/ml. Bereid 5 ml per plaat met 96 putten.
2. Verdun het faaglysaat met behulp van faagbuffer⁷ om 1 ml elk van 2,0 x 10⁶ pfu/ml, 2,0 x 10⁵ pfu/ml en 2,0 x 10⁴ pfu/ml concentraties te maken. Dit zorgt voor een multipliciteit van infectie (MOI) van 1, 0,1 en 0,01 binnen de microplaat⁹.
3. Om de microplaat te laden, neemt u een plaat die is bereid met een anticondensoplossing en agarose en pipet u 75 μL van de 2,0 x 10⁶ kve / ml bacteriën in kolommen 3-10, volgens figuur 1.
4. Voeg aan kolom 3 en kolom 4 75 μL steriele faagbuffer toe aan elke put om te dienen als een niet-faagpositieve controle, overeenkomstig figuur 1, en pipet op en neer om na elke toevoeging te mengen. Voeg 75 μL van de faag van 2,0 x 10 6 pfu/ml toe aan kolom 5 en kolom⁶ , 75 μl van de faag van 2,0 x 10⁵ pfu/ml aan kolom 7 en kolom 8, en 75 μl van de faag van 2,0 x 10⁴ pfu/ml aan kolom 9 en kolom 10, pipetterend op en neer om na elke toevoeging te mengen.
5. Plak beide korte zijden van de plaat af met 0,5 in etiketteertape om de plaat gedeeltelijk af te dichten en tegelijkertijd gasuitwisseling mogelijk te maken.

5. Incubatie- en absorptiemeting

1. Zodra de platen zijn geladen met bacteriën en fagen, plaatst u ze op een microplaatschudder bij 250 tpm en incubeert u ze bij 30 °C.
2. Incubeer de platen gedurende 96 uur en neem een optische dichtheidsmeting bij 600 nm op een microplaatlezer om de 8 uur vanaf uur 16. Breng de platen tussen de metingen door terug naar de schudder.
   OPMERKING: Meetperioden van 4, h 6 h, 8 h en 12 h werden beoordeeld, beginnend bij uur 0, en er werd vastgesteld dat een bemonsteringsperiode van 8 uur beginnend op 16 h na infectie de Gordonia-faaginteracties het best vastlegde.
3. Controleer het deksel tijdens het experiment op condensatie. Als condensatie wordt waargenomen, vervangt u het deksel door een ander deksel dat is gecoat volgens stap 3.2.
4. Genereer controle- en geïnfecteerde groeicurven volgens protocolsectie 6.

6. Data-analyse

1. Gebruik een spreadsheetprogramma om de gemiddelde en standaarddeviatie voor elke faagverdunning te berekenen, volgens de spreadsheetlay-out in de Stacy-Ceballos-Index GitHub-opslagplaats (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
2. Maak controle- en geïnfecteerde groeicurven en bereken infectiestatistieken met behulp van R (zie de materiaaltabel) met de pakketten DescTools²⁴, dplyr²⁵, ggplot2 26 en readxl²⁷ en volg het R-script in de Stacy-Ceballos-Index GitHub-repository (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
   1. AUC_con is het gebied onder de niet-geïnfecteerde controlecurve, terwijl AUC_inf het gebied onder de geïnfecteerde curve^{is 16}. Bereken de AUC en bereken vervolgens de procentuele groeiremming op basis van het gebied onder de curvewaarden, PI_AUC¹⁶, met behulp van de volgende vergelijking:
      (1 - [AUC_inf/AUC_con]) × 100
   2. De onderbroken horizontale lijnen op elke curve tonen de piekgroei, met de niet-geïnfecteerde groeipiek gelabeld N asymptoot (con) en de geïnfecteerde groeipiek gelabeld N_{asymptoot (inf).} Identificeer de_{N-asymptootwaarden} en bereken vervolgens het percentage groeiremming op basis van deze piekgroeiwaarden, PI_max¹⁶, met behulp van de volgende vergelijking:
      (1 - [N asymptoot(inf)/ N_{asymptoot(con})]₎ × 100
   3. Bereken de Stacy-Ceballos-index, I_SC¹⁶, als volgt uit de PI_AUC - en PI_max-waarden :
      (PI_AUC × PI_max) ^0,5
      Bereken de relatieve virulentie door de Stacy-Ceballos-index in de loop van de tijd¹⁶ te integreren.

Discussion

Deze op optische dichtheid gebaseerde microplaatmethode maakt onderzoek mogelijk naar bacteriofaaggastheerbereik en infectiedynamiek¹¹ en toont het nut van de Stacy-Ceballos-index¹⁶ als een maat voor bacteriofaagvirulentie. Hoewel deze methode kan worden gebruikt met elk bacteriofaag-gastheersysteem, is het specifiek ontworpen om snelle microplaatgroeitests 9,10,11 aan te passen voor gebruik met langzamer groeiende bacteriën zoals actinomyceten. Snelle microplaattests kunnen niet worden gebruikt voor langzaam groeiende bacteriën zonder aanpassingen om verdamping en dekselcondensatie aan te pakken. Deze methode beschrijft deze noodzakelijke wijzigingen en demonstreert voor het eerst het gebruik van de Stacy-Ceballos-index en gerelateerde statistieken¹⁶ om bacteriofaaginfectie te beschrijven.

Verdamping kan een aanzienlijke uitdaging zijn in meerdaagse 96-well plaatgroeicurve-assays; Deze methode lost dat probleem op door Agarose toe te voegen aan de grensputten en de ruimtes tussen de putten. De agarose marge, gecombineerd met de anti-fog dekselbehandeling²², zorgt voor de nodige vochtigheid in de microplaat en maakt betrouwbare optische dichtheidsmetingen mogelijk. Zonder de toegevoegde vochtigheid treedt aanzienlijke randeffectverdamping^{op 23} tijdens de vereiste lange incubatietijd, wat leidt tot kunstmatig hoge optische dichtheidsmetingen. De anti-condens dekselbehandeling is een noodzakelijke aanpassing omdat dekselcondensatie ook de optische dichtheidswaarden kunstmatig kan verhogen. Het schudden van de platen tijdens de incubatietijd is een aanbevolen modificatie, omdat actinomycete-bacteriën tijdens de groei kunnen klonteren, kunstmatig hoge optische dichtheidswaarden geven en de veelheid van infecties effectief verminderen.

De verhouding tussen bacteriën en fagen in experimenten die de infectiedynamiek karakteriseren, is van cruciaal belang, omdat er voldoende faag moet zijn om een infectie-effect te laten zien, maar niet zo veel dat de bacteriepopulatie van de gastheer onmiddellijk crasht⁹ of de frequentie van lysogenie dramatisch wordt verhoogd²⁸. In deze methode was de verhouding die het meest effectief bleek voor het verkrijgen van consistente resultaten een MOI van 1, maar bruikbare resultaten werden ook verkregen met MOI's van 0,1 en 0,01. Bij het implementeren van deze methode wordt aanbevolen om één concentratie bacteriën te kiezen en meerdere faagconcentraties te testen in het MOI-bereik van 0,01-1 9,10,11.

Met deze hier beschreven techniek kunnen bacteriofaag-gastheerinteracties worden beoordeeld op langzaam groeiende bacteriën in microplaattests met hoge doorvoer in plaats van met subbemonstering uit een grotere kweekkolf bij elk meetinterval²⁹. Verder, door aan te tonen hoe microplaatgroeitests 9,10,11 kunnen worden aangepast, verhoogt deze techniek het nut van andere op microplaten gebaseerde bacteriofaagtests voor langzamer groeiende bacteriën, waaronder faagkarakterisering 5,6,12 en evolutiestudies ^30,31. Ten slotte demonstreert deze methode het gebruik van de Stacy-Ceballos-index¹⁶ om bacteriofaaginfectie te beschrijven. Deze metriek is oorspronkelijk ontwikkeld met gegevens van een archaeaal virusmodelsysteem en wordt berekend op basis van optische dichtheidswaarden, waardoor het wijdverspreide nut heeft voor ongelijksoortige virussystemen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Omni-Pur	2090	for filling border wells of microplate
Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch	Corning	3931	replacement microplate lid
Isopropanol	Fisher Chemical	A461-4	for lid coating
Microplate reader	Tecan Spark 20M
Microplate Shaker with 4-Place Platform	Thermo Fisher Scientific	88-861-023	to shake plates during incubation
Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well	Falcon (a Corning Brand)	351172	microplate for growth curve assay
Peptone yeast calcium (PYCa) agar	Homemade		1 g peptone 15 g yeast extract 15 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide
Peptone yeast calcium (PYCa) broth	Homemade, from Reference 16		1 g peptone 15 g yeast extract 990 mL dd H2O 4.5 ml 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide
Peptone yeast calcium (PYCa) top agar	Homemade		1 g peptone 15 g yeast extract 4 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose
Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	for determination of bacterial concentration and phage titer assay
Phage Buffer	Homemade, from Reference 7		10 mL 1 M Tris, pH 7.5 10 mL 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd H2O
R software	https://www.r-project.org/	version 4.3.0
Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure	Thermo Fisher Scientific	4116-1000	for bacterial culture
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	for lid coating