עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSF DBI Biology Integration Institute (BII) (פרס מס' 2119968; PI-Ceballos) ועל ידי תוכנית INBRE של ארקנסו, עם מענק מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים, (NIGMS), P20 GM103429 מהמכונים הלאומיים לבריאות. המחברים מעריכים גם את התמיכה של תוכנית המחקר לתואר ראשון בקיץ של פטרסון באוניברסיטה הבפטיסטית וואצ'יטה.

בעוד פרוטוקול זה נכתב עבור Gordonia terrae, הוא שימש בהצלחה גם עבור Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta, ו Gordonia westfalica.
1. הכנת חיידקים
<ol><li>בארון בטיחות ביולוגית, השתמש בתרגול מיקרוביולוגי טוב17 כדי לחסן מושבה אחת של Gordonia terrae CAG3 לתוך בקבוק 1 ליטר סטרילי מבולבל עם 200 מ"ל של שמרי פפטון מרק סידן18 (PYCa) המכיל 0.01 מ"ג / מ"ל cycloheximide (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>לדגור את הבקבוק ב 30 ° C עם רעד ב 250 סל"ד עד התרבות רוויה או במשך 3 ימים7.</li>
	<li>יש לדלל באופן סדרתי את תרבית G. terrae הרוויה בציר PYCa, ולמרוח 100 μL כל אחד מהדילולים 10-4, 10-5 ו-10-6 על לוחות PYCa 19,20. מקררים את התרבית הרוויה הלא מדוללת ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לדגור את לוחות התפשטות הפוך במשך 3 ימים ב 30 ° C.</li>
	<li>לאחר הדגירה מזהים "צלחת ניתנת לספירה", צלחת עם 20-200 מושבות. ספרו את מספר המושבות על לוח זה, וחשבו את היחידות יוצרות המושבה למיליליטר (cfu/mL)19,20.</li>
	<li>לדלל את התרבית הרוויה עם ציר PYCa ל 4.0 x 106 cfu/mL חיידקים.</li>
</ol>2. הכנת פאגים
הערה: התוצאות המייצגות שדווחו התקבלו עם פאג גורדוניה דלריו21, בקטריופאג' ממוזג שבודד על G. terrae. שיטות אלה שימשו בהצלחה גם עם פאגים אחרים של גורדוניה .
<ol><li>החל מבקטריופאג' מבודד, מדללים סדרתית את דגימת הפאגים בחיץפאגים 7 לדילול של 1 x 10-8 . בצע בדיקת אגר פאג titer7 דו-שכבתית על ידי הדבקת 0.3 מ"ל של תרבית G. terrae רווי עם 10 μL של כל דילול פאגים. לאחר דגירה של 5-10 דקות בטמפרטורת החדר, ערבבו את תערובת החיידקים-פאגים עם 3 מ"ל של אגר עליון PYCa, ושפכו על צלחות אגר PYCa.</li>
	<li>לדגור את הלוחות הפוך ב 30 ° C במשך 3 ימים או עד פלאקים טופס7.</li>
	<li>לאחר הדגירה, זהה "צלחת ספירה", צלחת עם 20-200 לוחות. ספור את מספר הלוחות על לוח זה, וחשב יחידות יוצרות פלאק למיליליטר (pfu/mL)7.</li>
</ol>3. הכנת Microplate
הערה: יש להשתמש במיקרו-צלחות בעלות תחתית שטוחה של 96 בארות (ראה טבלת חומרים) עבור שיטה זו. יש להשלים את כל הכנת הצלחת והטענתה בארון בטיחות ביולוגית, ויש להשתמש בתרגול מיקרוביולוגי טוב17.
<ol><li>הכן את תמיסת ציפוי מכסה נגד ערפל על ידי שילוב של 100 μL של Triton-X 100, 40 מ"ל של 100% איזופרופנול, ו 160 מ"ל של מים deionized22. מערבבים לערבוב ומאחסנים בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>בארון בטיחות ביולוגית, הוסף 6 מ"ל של תמיסת ציפוי מכסה למשטח הפנימי של מכסה מיקרו-צלחת סטרילי בעל 96 בארות, החזק את המכסה בקצוות וסובב אותו כדי להבטיח שהוא מכוסה בתמיסה. תנו לתמיסה לשבת על המכסה למשך 20 שניות, ואז שפכו את התמיסה והפכו את המכסה על מגבת נייר בזווית עד שהמכסה יבש לחלוטין, מה שבדרך כלל לוקח 35-45 דקות. יש להקפיד להחזיק את המכסה בקצוות.</li>
	<li>הכינו 20 מ"ל של 0.1% אגרוז במים עבור כל מיקרו-צלחת 96 בארות, במיקרו כדי להמיס את האגרוז.</li>
	<li>לאחר שהאגרוז התקרר לטמפרטורה של 50-60 מעלות צלזיוס, צינור 100 מיקרוליטר של 0.1% האגרוז לתוך כל החללים שבין בארות הצלחת ו-200 מיקרוליטר של אגרוז לתוך הבארות בשורה A ובשורה H ועמודה 1, עמודה 2, עמודה 11 ועמודה 1223 (איור 1).</li>
</ol>4. העמסת הצלחת בחיידקים ופאגים
הערה: יש להשלים את כל הכנת הצלחת והטענתה בארון בטיחות ביולוגית, ויש להשתמש בתרגול מיקרוביולוגי טוב17 .
<ol><li>צלחת 96 בארות תכיל 75 μL של 2.0 x 106 cfu/mL חיידקים בכל באר9. לדלל את 4.0 x 106 cfu/mL תרבית חיידקים 1: 1 עם 2x ציר PYCa ל 2.0 x 106 cfu/mL. מכינים 5 מ"ל לכל צלחת 96 באר.</li>
	<li>דללו את הפאג' ליזט באמצעות חיץ פאגים7 כדי ליצור 1 מ"ל כל אחד בריכוזים של 2.0 x 106 pfu/mL, 2.0 x 105 pfu/mL ו-2.0 x 104 pfu/mL. זה יאפשר ריבוי של זיהום (MOI) של 1, 0.1, ו 0.01 בתוך microplate9.</li>
	<li>כדי להעמיס את צלחת המיקרו, קחו צלחת שהוכנה עם תמיסת אנטי-ערפל ואגרוז, ופיפט 75 μL של חיידקי 2.0 x 106 cfu/mL לעמודות 3-10, בעקבות איור 1.</li>
	<li>לעמודה 3 ולעמודה 4, הוסיפו 75 מיקרוליטר של חיץ פאגים סטרילי לכל באר כדי לשמש כבקרה חיובית ללא פאגים, בעקבות איור 1, ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב אחרי כל תוספת. הוסף 75 μL של הפאג 2.0 x 10 6 pfu/mL לעמודה 5 ולעמודה6 , 75 μL של הפאג 2.0 x 105 pfu/mL לעמודה 7 ולעמודה 8, ו- 75 μL של הפאג 2.0 x 104 pfu/mL לעמודה 9 ולעמודה 10, תוך פיטום למעלה ולמטה כדי לערבב לאחר כל תוספת.</li>
	<li>הדביקו את שני הצדדים הקצרים של הצלחת עם 0.5 בסרט תיוג כדי לאטום חלקית את הצלחת תוך מתן אפשרות להחלפת גזים.</li>
</ol>5. מדידת דגירה וספיגה
<ol><li>ברגע שהצלחות עמוסות בחיידקים ופאגים, הניחו אותן על שייקר מיקרו-צלחות ב-250 סל"ד, ודגרו ב-30°C.</li>
	<li>דגרו על הלוחות במשך 96 שעות, ובצעו מדידת צפיפות אופטית של 600 ננומטר בקורא מיקרו-צלחות כל 8 שעות החל משעה 16. מחזירים את הצלחות לשייקר בין המדידות. הערה: תקופות מדידה של 4, h 6 h, 8 h ו-12 h הוערכו, החל משעה 0, ונקבע כי תקופת דגימה של 8 שעות המתחילה ב-16 שעות לאחר ההדבקה לכדה בצורה הטובה ביותר את אינטראקציות גורדוניה-פאג'.</li>
	<li>נטרו את המכסה לעיבוי במהלך הניסוי. אם נצפה עיבוי, החליפו את המכסה במכסה אחר מצופה לפי שלב 3.2.</li>
	<li>יצירת בקרה ועקומות גדילה נגועות בהתאם לפרוטוקול סעיף 6.</li>
</ol>6. ניתוח נתונים
<ol><li>השתמש בתוכנית גיליון אלקטרוני כדי לחשב את הממוצע ואת סטיית התקן עבור כל דילול פאגים, בהתאם לפריסת הגיליון האלקטרוני במאגר GitHub של Stacy-Ceballos-Index (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).</li>
	<li>צור עקומות בקרה וגדילה נגועות, וחשב מדדי זיהום באמצעות R (ראה טבלת חומרים) עם חבילות DescTools24, dplyr 25, ggplot226 ו- readxl27 ועקוב אחר סקריפט R במאגר GitHub של Stacy-Ceballos-Index (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).<ol><li>AUC con הוא האזור מתחת לעקומת הבקרה הלא נגועה, בעוד AUCinf הוא האזור מתחת לעקומה הנגועה16. חשב את AUC ולאחר מכן חשב עיכוב צמיחה באחוזים בהתבסס על האזור מתחת לערכי העקומה, PIAUC16, באמצעות המשוואה הבאה: (1 - [AUCinf/AUCcon]) × 100</li>
		<li>הקווים האופקיים המקווקווים בכל עקומה מראים את שיא הצמיחה, כאשר שיא הצמיחה הלא נגוע מסומן N asymptote(con) ושיא הצמיחה הנגוע מסומן Nasymptote(inf). זהה את ערכיN אסימפטוטה ולאחר מכן חשב עיכוב גדילה באחוזים בהתבסס על ערכי שיא גדילה אלה, PImax16, באמצעות המשוואה הבאה: (1 - [N asymptote(inf)/ Nasymptote(con)]) × 100</li>
		<li>חשב את מדד Stacy-Ceballos, ISC16, מתוך ערכי PIAUC ו- PI max , כדלקמן: (PIAUC × PImax) 0.5 חישוב אלימות יחסית על ידי שילוב מדד Stacy-Ceballos לאורך זמן16.</li>
	</ol></li>
</ol>

אפיון זיהום אקטינובקטריופאג' באמצעות בדיקת צפיפות אופטית מותאמת

<ol>
	<li>Mushegian, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+there+1031+virus+particles+on+Earth,+or+more,+or+fewer.">Are there 1031 virus particles on Earth, or more, or fewer.</a> Journal of Bacteriology. 202 (9), e00052-e00020 (2020).</li><li>Chevallereau, A., Pons, B. J., van Houte, S., Westra, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+bacterial+and+phage+communities+in+natural+environments.">Interactions between bacterial and phage communities in natural environments.</a> Nature Reviews Microbiology. 20 (1), 49-62 (2022).</li><li>Olszak, T., Latka, A., Roszniowski, B., Valvano, M. A., Drulis-Kawa, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+life+cycles+behind+bacterial+biodiversity.">Phage life cycles behind bacterial biodiversity.</a> Current Medicinal Chemistry. 24 (36), 3987-4001 (2017).</li><li>Weitz, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage-bacteria+infection+networks.">Phage-bacteria infection networks.</a> Trends in Microbiology. 21 (2), 82-91 (2013).</li><li>Turner, P. E., Draghi, J. A., Wilpiszeski, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analysis+of+growth+differences+among+phage+strains.">High-throughput analysis of growth differences among phage strains.</a> Journal of Microbiological Methods. 88 (1), 117-121 (2012).</li><li>Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+virulence+index:+A+metric+for+quantitative+analysis+of+phage+virulence.">The virulence index: A metric for quantitative analysis of phage virulence.</a> PHAGE. 1 (1), 27-36 (2020).</li><li>. Phage Discovery Guide Available from: <a target="_blank" href="https://seaphagesphagediscoveryguide.helpdocsonline.com/home">https://seaphagesphagediscoveryguide.helpdocsonline.com/home</a> (2012)</li><li>Martinez-Soto, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHIDA:+A+high+throughput+turbidimetric+data+analytic+tool+to+compare+host+range+profiles+of+bacteriophages+isolated+using+different+enrichment+methods.">PHIDA: A high throughput turbidimetric data analytic tool to compare host range profiles of bacteriophages isolated using different enrichment methods.</a> Viruses. 13 (11), 2120-2137 (2021).</li><li>Rajnovic, D., Mu&#241;oz-Berbel, X., Mas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+phage+detection+and+quantification:+An+optical+density-based+approach.">Fast phage detection and quantification: An optical density-based approach.</a> PLoS One. 14 (5), e0216292 (2019).</li><li>Xie, Y., Wahab, L., Gill, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+microtiter+plate-based+assay+for+determination+of+bacteriophage+host+range+and+virulence.">Development and validation of a microtiter plate-based assay for determination of bacteriophage host range and virulence.</a> Viruses. 10 (4), 189-204 (2018).</li><li>S&#248;rensen, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+in+vitro+phage-host+population+growth+dynamics.">Classification of in vitro phage-host population growth dynamics.</a> Microorganisms. 9 (12), 2470-2486 (2021).</li><li>Konopacki, M., Grygorcewicz, B., Do&#322;&#281;gowska, B., Kordas, M., Rakoczy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhageScore:+A+simple+method+for+comparative+evaluation+of+bacteriophages+lytic+activity.">PhageScore: A simple method for comparative evaluation of bacteriophages lytic activity.</a> Biochemical Engineering Journal. 161, 107652 (2020).</li><li>Holt, J. G., Krieg, N. R., Sneath, P. H. A., Staley, J. T., Williams, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bergey's Manual of Determinative Bacteriology., 9th edition. , (1994).</li><li>Fusconi, R., Godinho, M. J. L., Bossolan, N. R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+exopolysaccharide+production+from+sugarcane+molasses+by+Gordonia+polyisoprenivorans+CCT+7137,+isolated+from+contaminated+groundwater+in+Brazil.">Culture and exopolysaccharide production from sugarcane molasses by Gordonia polyisoprenivorans CCT 7137, isolated from contaminated groundwater in Brazil.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (7), 937-943 (2007).</li><li>Bujold, A. R., Lani, N. R., Sanz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-to-strain+variation+of+Rhodococcus+equi+growth+and+biofilm+formation+in+vitro.">Strain-to-strain variation of Rhodococcus equi growth and biofilm formation in vitro.</a> BMC Research Notes. 12 (1), 519 (2019).</li><li>Ceballos, R. M., Stacy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+relative+virulence:+When+&#181;max+fails+and+AUC+alone+just+is+not+enough.">Quantifying relative virulence: When &#181;max fails and AUC alone just is not enough.</a> Journal of General Virology. 102 (1), 001515 (2021).</li><li>Siddiquee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+concept+of+microbiology.">The basic concept of microbiology.</a> Practical Handbook of the Biology and Molecular Diversity of Trichoderma Species from Tropical Regions. , 1-15 (2017).</li><li>Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+and+characterization+of+the+Tsukamurella+bacteriophage+TPA2.">Genome sequence and characterization of the Tsukamurella bacteriophage TPA2.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (4), 1389-1398 (2011).</li><li>Growth curves: Generating growth curves using colony forming units and optical density measurements. JoVE Science Education Database. Microbiology Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/v/10511/growth-curvesgenerating-growth-curves-using-colony-forming-units">https://www.jove.com/v/10511/growth-curvesgenerating-growth-curves-using-colony-forming-units</a> (2023)</li><li>Preparing spread plates protocols. American Society for Microbiology Available from: <a target="_blank" href="https://asm.org/ASM/media/Protocol-Images/Preparing-Spread-Plates-Protocols.pdf">https://asm.org/ASM/media/Protocol-Images/Preparing-Spread-Plates-Protocols.pdf</a> (2006)</li><li>Mathes, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequences+of+Chop,+DelRio,+and+GrandSlam,+three+Gordonia+phages+isolated+from+soil+in+Central+Arkansas.">Complete genome sequences of Chop, DelRio, and GrandSlam, three Gordonia phages isolated from soil in Central Arkansas.</a> Microbiology Resource Announcements. 12 (5), e0002323 (2023).</li><li>Krishnamurthi, V. R., Niyonshuti, I. I., Chen, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+analysis+method+for+evaluating+bacterial+growth+with+microplate+readers.">A new analysis method for evaluating bacterial growth with microplate readers.</a> PLoS One. 16 (1), 0245205 (2021).</li><li>DescTools: Tools for descriptive statistics, R package version 0.99.49. DescTools Available from: <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=DescTools">https://CRAN.R-project.org/package=DescTools</a> (2023)</li><li>. dplyr: A grammar of data manipulation, R package version 1.1.2 Available from: <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=dplyr">https://CRAN.R-project.org/package=dplyr</a> (2023)</li><li>. ggplot2: Create elegant data visualisations using the grammar of graphics, R package version 3.4.2 Available from: <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=ggplot2">https://CRAN.R-project.org/package=ggplot2</a> (2023)</li><li>. readxl: Read excel files, R package version 1.4.2 Available from: <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=readxl">https://CRAN.R-project.org/package=readxl</a> (2023)</li><li>Yao, T., Coleman, S., Nguyen, T. V. P., Golding, I., Igoshin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+self-counting+in+the+presence+of+viral+replication.">Bacteriophage self-counting in the presence of viral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (51), 2104163118 (2021).</li><li>Fang, Q., Feng, Y., McNally, A., Zong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+phage+resistance+and+phages+capable+of+intestinal+decolonization+of+carbapenem-resistant+Klebsiella+pneumoniae+in+mice.">Characterization of phage resistance and phages capable of intestinal decolonization of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in mice.</a> Communications Biology. 5, 48 (2022).</li><li>Burrowes, B. H., Molineux, I. J., Fralick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+in+vitro+evolution+of+therapeutic+bacteriophages:+The+Appelmans+protocol.">Directed in vitro evolution of therapeutic bacteriophages: The Appelmans protocol.</a> Viruses. 11 (3), 241 (2019).</li><li>Shapiro, J. W., Williams, E. S. C. P., Turner, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+parasitism+and+mutualism+between+filamentous+phage+M13+and+Escherichia+coli.">Evolution of parasitism and mutualism between filamentous phage M13 and Escherichia coli.</a> PeerJ. 4, e2060 (2013).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שיטת מיקרו-צלחות מבוססת צפיפות אופטית זו מאפשרת לחקור את טווח מארח הבקטריופאג' ואת דינמיקת הזיהום11 ומראה את התועלת של מדד Stacy-Ceballos16 כמדד לאלימות הבקטריופאג'ים. בעוד שניתן להשתמש בשיטה זו עם כל מערכת בקטריופאג'-מארח, היא תוכננה במיוחד כדי להתאים מבחני גדילה מהיריםשל מיקרו-צלחות 9,10,11 לשימוש עם חיידקים הגדלים לאט יותר כגון אקטינומיצטים. לא ניתן להשתמש במבחני מיקרו-צלחות מהירים עבור חיידקים הגדלים לאט ללא שינויים לטיפול באידוי ועיבוי מכסים. שיטה זו מתארת שינויים הכרחיים אלה ומדגימה לראשונה את השימוש במדד Stacy-Ceballos ובמדדים קשורים16 לתיאור זיהום בקטריופאג'ים.
אידוי יכול להוות אתגר משמעותי במבחני עקומת צמיחת לוחות רב-יומיים של 96 בארות; שיטה זו פותרת בעיה זו על ידי הוספת אגרוז לבארות הגבול ולרווחים שבין הבארות. שולי האגרוז, בשילוב עם טיפול נגד מכסה ערפל22, מספקים את הלחות הדרושה בתוך המיקרו-צלחת ומאפשרים מדידות צפיפות אופטית אמינות. ללא תוספת לחות, אידוי אפקט קצה משמעותי מתרחש23 במהלך תקופת הדגירה הארוכה הנדרשת, מה שמוביל לקריאות צפיפות אופטית גבוהה באופן מלאכותי. הטיפול במכסה נגד ערפל הוא שינוי הכרחי מכיוון שעיבוי מכסה יכול גם להעלות באופן מלאכותי את ערכי הצפיפות האופטית. ניעור הצלחות במהלך תקופת הדגירה הוא שינוי מומלץ, שכן חיידקי אקטינומיצט עלולים להתגבש במהלך הצמיחה, לתת ערכי צפיפות אופטית גבוהים באופן מלאכותי ולהפחית ביעילות את ריבוי הזיהום.
היחס בין חיידקים לפאגים בניסויים המאפיינים דינמיקה של זיהום הוא קריטי, מכיוון שחייבים להיות מספיק פאגים כדי להראות אפקט זיהום, אבל לא רבים כל כך שאוכלוסיית החיידקים המארחים קורסת מיד9 או שתדירות הליזוגניות גדלה באופן דרמטי28. בשיטה זו, היחס שנמצא כיעיל ביותר לקבלת תוצאות עקביות היה MOI של 1, אך תוצאות שמישות התקבלו גם עם MOI של 0.1 ו-0.01. בעת יישום שיטה זו, מומלץ לבחור ריכוז אחד של חיידקים ולבדוק ריכוזי פאגים מרובים בטווח MOI של 0.01-1 9,10,11.
טכניקה זו המתוארת כאן מאפשרת להעריך אינטראקציות בקטריופאג'-מארח עבור חיידקים הגדלים לאט במבחני מיקרו-צלחות בעלי תפוקה גבוהה, במקום באמצעות תת-דגימה מבקבוק תרבית גדול יותר בכל מרווח מדידה29. יתר על כן, על ידי הדגמת האופן שבו ניתן להתאים מבחני גדילה של מיקרו-צלחות 9,10,11, טכניקה זו מגדילה את התועלת של מבחני בקטריופאג'ים אחרים מבוססי מיקרו-צלחות עבור חיידקים הגדלים לאט יותר, כולל אפיון פאגים5,6,12 ומחקרי אבולוציה 30,31. לבסוף, שיטה זו מדגימה את השימוש במדד Stacy-Ceballos16 לתיאור זיהום בקטריופאג'ים. מדד זה פותח בתחילה עם נתונים ממערכת מודל וירוסים ארכאית והוא מחושב מערכי צפיפות אופטית, ובכך מעניק לו תועלת נרחבת במערכות וירוסים שונות.

בקטריופאג'ים או פאגים הם וירוסים שמדביקים חיידקים. הם הישויות הביולוגיות הרבות ביותר על פני כדור הארץ1, ומקובל כי בקטריופאג'ים משפיעים על אבולוציה חיידקית ועל תהליכים אקולוגיים 2,3,4. קיימות מספר שיטות לתאר, למדוד ולנתח טווח מארח בקטריופאג' 8 ודינמיקת זיהום5,6, כולל שיטות מבוססות אגר כגון שיטת אגר דו-שכבתית7 ושיטות מיקרו-לוחות מבוססות צפיפות אופטית8,9,10,11,12. לכל שיטה יתרונות וחסרונות משלה. בשל יעילותן, בדיקות ציפוי בשיטת אגר דו-שכבתית הן "תקן הזהב" למבחני טווח מארחים, אך שיטה זו דורשת זמן ועבודה9. שיטות מיקרו-צלחות מהירות, אשר מחזירות תוצאות תוך 24 שעות או פחות, נותנות תוצאות מצוינות עבור מארחים חיידקיים הגדלים במהירות כגון Escherichia coli 9,10,11,12, אך הן קצרות מכדי להציג את התקדמות זיהום הבקטריופאג' בפונדקאים חיידקיים הגדלים לאט יותר כגון אקטינומיצטים 7,13,14,15.
בדיקת מיקרו-צלחות מבוססת צפיפות אופטית המיועדת לחיידקים הגדלים במהירות אינה יכולה להיות מופעלת במשך הימים המרובים הנדרשים כדי לאפיין את דינמיקת הזיהום בחיידק מארח הגדל לאט מבלי שתתרחש אידוי ותעניק צפיפות חיידקים גבוהה באופן מלאכותי. לפיכך, השגת נתונים דומים בתפוקה גבוהה על דינמיקת זיהום בקטריופאג'ים עבור מיני חיידקים הגדלים לאט דורשת טכניקות מיוחדות המותאמות לחיידקים אלה.
שיטת המיקרו-צלחות המוצגת כאן מפחיתה את האידוי, ובכך מאפשרת לחיידקים הגדלים לאט להיות בתרבית משותפת עם פאג לתקופה ממושכת של 96 שעות ומאפשרת לחקור את דינמיקת זיהום הפאגים ואת טווח המאכסן. שיטה זו מציגה גם את מדד Stacy-Ceballos16, מדד מבוסס צפיפות אופטית המאפשר השוואות אלימות בין מערכות וירוסים מארחים שונות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Omni-Pur</td>
			<td>2090</td>
			<td>for filling border wells of microplate&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3931</td>
			<td>replacement microplate lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A461-4</td>
			<td>for lid coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Tecan Spark 20M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Shaker with 4-Place Platform</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td>to shake plates during incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well</td>
			<td>Falcon (a Corning Brand)</td>
			<td>351172</td>
			<td>microplate for growth curve assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone yeast calcium (PYCa) agar</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1 g peptone 
			15 g yeast extract 
			15 g agar 
			990 mL dd H2O 
			4.5 mL 1 M CaCl2 
			2.5 mL 40% dextrose 
			1 mL 10 mg/mL cycloheximide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone yeast calcium (PYCa) broth</td>
			<td>Homemade, from Reference 16</td>
			<td></td>
			<td>1 g peptone 
			15 g yeast extract 
			990 mL dd H2O 
			4.5 ml 1 M CaCl2 
			2.5 mL 40% dextrose 
			1 mL 10 mg/mL cycloheximide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone yeast calcium (PYCa) top agar</td>
			<td>Homemade</td>
			<td></td>
			<td>1 g peptone 
			15 g yeast extract 
			4 g agar 
			990 mL dd H2O 
			4.5 mL 1M CaCl2 
			2.5 mL 40% dextrose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>for determination of bacterial concentration and phage titer assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phage Buffer</td>
			<td>Homemade, from Reference 7</td>
			<td></td>
			<td>10 mL 1 M Tris, pH 7.5 
			10 mL 1 M MgSO4 
			4 g NaCl 
			980 ml dd H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R software</td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
			<td>version 4.3.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4116-1000</td>
			<td>for bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>for lid coating</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an adapted optical density-based microplate assay for characterizing actinobacteriophage infection

בקטריופאג'ים הם חלק מרכזי בסביבות טבעיות, ויש להם יכולת רבת עוצמה לעצב אוכלוסיות חיידקים. כדי להבין כיצד פאגים בודדים מתקשרים עם פונדקאים חיידקיים הגדלים לאט, כגון אקטינומיצטים, יש צורך בשיטה קלה ואמינה לכימות גידול חיידקים ארוך טווח בנוכחות פאגים. קוראי מיקרו-לוחות ספקטרופוטומטריים מאפשרים מדידות חוזרות בתפוקה גבוהה, אך דגירה של נפח קטן למשך זמן ממושך עלולה להציב אתגרים טכניים. הליך זה מתאים מיקרו-צלחת סטנדרטית של 96 בארות כדי לאפשר תרבית משותפת של פאגים וחיידקים ללא תת-דגימה במשך 96 שעות, כאשר צמיחת החיידקים נרשמת כל 8 שעות באמצעות ערכי ספיגה ספקטרופוטומטריים. ערכי צפיפות אופטית אלה מנותחים באמצעות R כדי להניב מדדי זיהום, כולל עיכוב הצמיחה באחוזים, אלימות יחסית ומדד Stacy-Ceballos. השיטות המתוארות כאן מספקות דרך יעילה לנהל ולנתח ניסויים בעקומת גדילה של מיקרו-צלחות ממושכות וכוללות שינויים להפחתת אידוי ועיבוי מכסים. פרוטוקולים אלה מאפשרים בדיקות מבוססות מיקרו-צלחות של אינטראקציות בין מארחי חיידקים הגדלים לאט לבין הבקטריופאג'ים שלהם.

Bacteriophages or phages are viruses that infect bacteria. They are the most numerous biological entities on the planet1, and it is generally accepted that bacteriophages influence bacterial evolution and ecosystem processes2,3,4. Several methods exist to describe, measure, and analyze bacteriophage host range8 and infection dynamics5,6, including agar-based methods such as the double-layer agar method7 and optical density-based microplate methods8,9,10,11,12. Each method has its own advantages and disadvantages. Due to their efficiency, plating tests using the double-layer agar method are the &#34;gold standard&#34; for host range assays, but this method is time- and labor-intensive9. Rapid microplate methods, which return results in 24 h or less, give excellent results for fast-growing bacterial hosts such as Escherichia coli9,10,11,12 but are too brief to showcase bacteriophage infection progression in slower-growing bacterial hosts such as actinomycetes7,13,14,15.
An optical density-based microplate assay designed for fast-growing bacteria cannot be run for the multiple days required to characterize infection dynamics in a slow-growing host bacterium without evaporation occurring and giving artificially high bacterial densities. Thus, obtaining comparable high-throughput data on bacteriophage infection dynamics for slow-growing bacterial species requires specialized techniques adapted for these bacteria.
The microplate method presented here reduces evaporation, thus allowing slow-growing bacteria to be co-cultured with a phage for an extended 96 h period and enabling investigations into phage infection dynamics and host range. This method also showcases the Stacy-Ceballos index16, an optical density-based metric that allows for virulence comparisons among disparate host-virus systems.

Author Spotlight: בדיקת מיקרו-פלטה מותאמת מבוססת צפיפות אופטית לאפיון זיהום אקטינובקטריופאג'  

בדיקת מיקרו-צלחות מותאמת מבוססת צפיפות אופטית לאפיון זיהום אקטינובקטריופאג'

Ultimately, we're interested in bacteriophage-host interactions. This protocol enables the measurement of phage infection in slow-growing bacteria, generating descriptive infection metrics. This methodology is instrumental in studying bacteriophage-host coevolution in slow-growing Actinomycete bacteria.Rapid microplate methods give excellent results for fast-growing bacterial hosts, but are too brief to showcase bacteria-phage infection progression in slower growing bacterial hosts, such as actinomycetes. Our method is adapted for slow-growing bacteria, allowing bacteria and phage to be co-cultured for the multiple days required to characterize the bacteriophage infection dynamics. Our protocol allows bacteriophage-host interactions to be assessed for slow-growing bacteria in microplates rather than requiring sub-sampling from a larger culture flask.This protocol uses readily available materials to adapt for extended culture times and allows multiple replicates to be plated in a single microplate.

ניסוי מוצלח אם עקומת הגדילה המתקבלת מראה גידול באוכלוסיית חיידקי הבקרה החיובית לאורך זמן ללא תנודות פתאומיות בספיגה. דוגמאות לניסוי מוצלח ב-MOI של 1 עם וללא זיהום פאגים פרודוקטיבי מוצגות באיור 2 ובאיור 3, בהתאמה. זיהום פרודוקטיבי ב-MOI של 0.01 מיוצג באיור 4. דפוס הגדילה החיובי (העקומה הירוקה) שנראה בכל שלושת האיורים מצביע על כך שהחיידקים גדלים, הם אינם מתגבשים במהלך הגדילה, ואין מזהמים. גושים וזיהום מסומנים על ידי ספיגה גבוהה במיוחד בנקודת זמן אחת. סטיות תקן בדרך כלל גדלות במהלך הזמן של ניסוי; עם זאת, עלייה דרסטית או סטיות תקן החופפות בין עקומת הבקרה לעקומות הנגועות עשויות להצביע על זיהום או התגבשות בבאר אחת או יותר.
עקומת הגדילה המתארת זיהום פאגים פרודוקטיבי, המיוצג על-ידי איור 2, מראה ספיגת חיידקים מופחתת לאורך זמן בבארות עם הוספת הפאגים. הירידה הזו בצפיפות החיידקים לא תיראה אם החיידק נמצא מחוץ לטווח המאכסן של הפאגים, כפי שמוצג באיור 3.
מדדי זיהום מוצגים עבור כל הניסויים המייצגים, עם I SC גדול יחסית עבור הזיהומים הפרודוקטיביים באיור 2 ובאיור 4 ו-ISC קטן מאוד באיור 3 עבור הפאגים שלא הדביקו ביעילות את החיידק המארח.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65482/65482fig01.jpg"> איור 1: פריסת מיקרו-לוחות. האזורים האפורים מלאים ב-0.1% אגרוז. הבארות הריקות בעמודה 3 ובעמודה 4 הן בארות בקרה חיוביות ללא פאגים המכילות רק חיץ פאגים וחיידקים בגודל 2.0 x 106 cfu/mL. הבארות המנוקדות מכילות פאגים וחיידקים בגודל 2.0 x 106 cfu/mL; הנקודות הגדולות בעמודה 5 ובעמודה 6 מציינות MOI של 1 עם פאג בגודל 2.0 x 106 pfu/mL; הנקודות הבינוניות בעמודה 7 ובעמודה 8 מציינות MOI של 0.1 עם פאג בגודל 2.0 x 105 pfu/mL; והנקודות הקטנות בעמודה 9 ובעמודה 10 מציינות MOI של 0.01 עם פאג בגודל 2.0 x 104 pfu/mL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65482/65482fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65482/65482fig02.jpg"> איור 2: ניסוי מוצלח בעקומת גדילה עם פאג ב-MOI של 1 שמדביק באופן פרודוקטיבי את החיידק המארח. ערכי הספיגה הממוצעים (± סטיית תקן) מוצגים עבור חיידקים לא נגועים (ירוק) וחיידקים עם תוספת פאגים (כחול). קיצורים: AUC = שטח מתחת לעקומה; PIAUC = אחוז עיכוב גדילה המחושב מהאזור שמתחת לעקומה; Nאסימפטוטה = ערך צמיחה שיא; PImax = אחוז עיכוב גדילה המחושב מערכי שיא הצמיחה; ISC = אינדקס Stacy-Ceballos. גרף זה מייצג את פאג גורדוניה הממוזג דלריו המדביק את G. terrae, החיידק שעליו בודד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65482/65482fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65482/65482fig03.jpg"> איור 3: ניסוי מוצלח בעקומת גדילה עם פאג ב-MOI של 1 שאינו מדביק ביעילות את החיידק המארח. ערכי הספיגה הממוצעים (± סטיית תקן) מוצגים עבור חיידקים לא נגועים (ירוק) וחיידקים עם תוספת פאגים (כחול). קיצורים: AUC = שטח מתחת לעקומה; PIAUC = אחוז עיכוב גדילה המחושב מהאזור שמתחת לעקומה; Nאסימפטוטה = ערך צמיחה שיא; PImax = אחוז עיכוב גדילה המחושב מערכי שיא הצמיחה; ISC = אינדקס Stacy-Ceballos. גרף זה מייצג זיהום G. rubripertincta על ידי DelRio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65482/65482fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65482/65482fig04.jpg"> איור 4: ניסוי מוצלח בעקומת גדילה עם פאג ב-MOI של 0.01. ערכי הספיגה הממוצעים (± סטיית תקן) מוצגים עבור חיידקים לא נגועים (ירוק) וחיידקים עם תוספת פאגים (כחול). קיצורים: AUC = שטח מתחת לעקומה; PIAUC = אחוז עיכוב גדילה המחושב מהאזור שמתחת לעקומה; Nאסימפטוטה = ערך צמיחה שיא; PImax = אחוז עיכוב גדילה המחושב מערכי שיא הצמיחה; ISC = אינדקס Stacy-Ceballos. גרף זה מייצג את זיהום G. terrae על ידי DelRio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65482/65482fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Adapted Optical Density-Based Microplate Assay for Characterizing Actinobacteriophage Infection at JoVE.com

מתוארת שיטת מיקרו-פלטה מבוססת צפיפות אופטית לכימות גידול חיידקים ארוך טווח בנוכחות בקטריופאג'ים, המתאימים לאקטינומיצטים ולחיידקים אחרים הגדלים לאט. שיטה זו כוללת שינויים להפחתת אידוי ועיבוי מכסים וקוד R לחישוב מדדי הדבקה בנגיף, כולל השטח שמתחת לעקומה, מקסימום צמיחה ואלימות יחסית.

Bacteriophages are a key part of natural environments, and they have a powerful ability to shape bacterial populations. To understand how individual ...

בסופו של דבר, אנו מתעניינים באינטראקציות בין בקטריופאג'ים למארחים. פרוטוקול זה מאפשר מדידה של זיהום פאגים בחיידקים הגדלים לאט, ומייצר מדדי זיהום תיאוריים. מתודולוגיה זו היא חיונית בחקר קו-אבולוציה של בקטריופאג'-מארח בחיידקי אקטינומיצט הגדלים לאט.שיטות מיקרו-צלחות מהירות מספקות תוצאות מצוינות עבור פונדקאים חיידקיים הגדלים במהירות, אך הן קצרות מכדי להציג את התקדמות זיהום חיידקי-פאג' בפונדקאים חיידקיים הגדלים לאט יותר, כגון אקטינומיצטים. השיטה שלנו מותאמת לחיידקים הגדלים לאט, ומאפשרת תרבית משותפת של חיידקים ופאגים במשך הימים המרובים הנדרשים כדי לאפיין את דינמיקת הזיהום של הבקטריופאג'ים. הפרוטוקול שלנו מאפשר להעריך אינטראקציות בקטריופאג'-מארח עבור חיידקים הגדלים לאט בצלחות מיקרו, במקום לדרוש תת-דגימה מבקבוק תרבית גדול יותר.פרוטוקול זה משתמש בחומרים זמינים כדי להסתגל לזמני תרבית ארוכים יותר ומאפשר לצפות עותקים משוכפלים מרובים במיקרו-צלחת אחת.

בדיקת מיקרו-צלחות מותאמת מבוססת צפיפות אופטית לאפיון זיהום אקטינובקטריופאג'

Abstract