Um ensaio adaptado baseado em densidade óptica em microplacas para caracterizar a infecção por actinobacteriófagos

Summary

Um método de microplacas baseado em densidade óptica é descrito para quantificar o crescimento bacteriano a longo prazo na presença de bacteriófagos, adequado para actinomicetos e outras bactérias de crescimento lento. Este método inclui modificações para reduzir a evaporação e condensação da pálpebra e código R para calcular métricas de infecção viral, incluindo a área sob a curva, o máximo de crescimento e a virulência relativa.

Abstract

Os bacteriófagos são uma parte fundamental dos ambientes naturais e têm uma poderosa capacidade de moldar populações bacterianas. Para entender como fagos individuais interagem com hospedeiros bacterianos de crescimento lento, como actinomicetos, um método fácil e confiável para quantificar o crescimento bacteriano a longo prazo na presença de fagos é necessário. Os leitores de microplacas espectrofotométricas permitem medições repetidas de alto rendimento, mas incubar um pequeno volume por um tempo prolongado pode apresentar desafios técnicos. Este procedimento adapta uma microplaca padrão de 96 poços para permitir a co-cultura de fagos e bactérias sem subamostragem por 96 h, com o crescimento bacteriano registrado a cada 8 h usando valores espectrofotométricos de absorbância. Esses valores de densidade óptica são analisados usando R para produzir métricas de infecção, incluindo a inibição percentual de crescimento, virulência relativa e o índice de Stacy-Ceballos. Os métodos descritos aqui fornecem uma maneira eficaz de conduzir e analisar experimentos de curva de crescimento de microplacas de duração prolongada e incluem modificações para reduzir a evaporação e a condensação da tampa. Esses protocolos facilitam ensaios baseados em microplacas de interações entre hospedeiros bacterianos de crescimento lento e seus bacteriófagos.

Introduction

Bacteriófagos ou fagos são vírus que infectam bactérias. São as entidades biológicas mais numerosas do^planeta1, sendo geralmente aceito que os bacteriófagos influenciam a evolução bacteriana e os processos ecossistêmicos ^2,3,4. Existem vários métodos para descrever, medir e analisar a gama de hospedeiros bacteriófagos 8 e a dinâmica da infecção^5,6, incluindo métodos baseados em ágar como o método de ágar camada dupla⁷ e métodos de microplacas baseados em densidade óptica ^8,9,10,11,12. Cada método tem suas próprias vantagens e desvantagens. Devido à sua eficiência, os testes de plaqueamento utilizando o método de ágar camada dupla são o "padrão ouro" para ensaios de gama de hospedeiros, mas esse método^{consome tempo} e trabalho9. Métodos rápidos de microplacas, que retornam resultados em 24 h ou menos, fornecem excelentes resultados para hospedeiros bacterianos de crescimento rápido, como Escherichia coli 9,10,11,12, mas são muito breves para mostrar a progressão da infecção por bacteriófagos em hospedeiros bacterianos de crescimento mais lento, como os actinomicetos 7,13,14,15.

Um ensaio de microplaca baseado em densidade óptica projetado para bactérias de crescimento rápido não pode ser executado pelos vários dias necessários para caracterizar a dinâmica da infecção em uma bactéria hospedeira de crescimento lento sem que ocorra evaporação e dê densidades bacterianas artificialmente altas. Assim, a obtenção de dados comparáveis de alto rendimento sobre a dinâmica da infecção por bacteriófagos para espécies bacterianas de crescimento lento requer técnicas especializadas adaptadas para essas bactérias.

O método de microplacas aqui apresentado reduz a evaporação, permitindo que bactérias de crescimento lento sejam co-cultivadas com um fago por um período prolongado de 96 h e permitindo investigações sobre a dinâmica da infecção por fagos e a gama de hospedeiros. Este método também apresenta o índice Stacy-Ceballos¹⁶, uma métrica baseada em densidade óptica que permite comparações de virulência entre sistemas de vírus hospedeiros díspares.

Protocol

Embora este protocolo seja escrito para Gordonia terrae, ele também foi usado com sucesso para Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta, e Gordonia westfalica.

1. Preparação de bactérias

1. Em um gabinete de biossegurança, utilizar boas práticas microbiológicas¹⁷ para inocular uma única colônia de Gordonia terrae CAG3 em um frasco compartimentado estéril de 1 L com 200 mL de caldo de cálcio de levedura peptona¹⁸ (PYCa) contendo 0,01 mg/mL de cicloheximida (ver Tabela de Materiais).
2. Incubar o balão a 30 °C com agitação a 250 rpm até que a cultura esteja saturada ou durante 3 dias⁷.
3. Diluir serialmente a cultura saturada de G. terrae em caldo PYCa e espalhar 100 μL de cada uma das diluições de 10−4, 10−⁵ e 10⁻⁶ em placas de PYCa ^19,20. Refrigerar a cultura saturada não diluída a 4 °C.
4. Incubar as placas de espalhamento invertidas durante 3 dias a 30 °C.
5. Após a incubação, identifique uma "placa contável", uma placa com 20-200 colônias. Contar o número de colônias nessa placa e calcular as unidades formadoras de colônias por mililitro (ufc/mL)^19,20.
6. Diluir a cultura saturada com caldo PYCa para 4,0 x 10⁶ ufc/mL de bactérias.

2. Preparação de fagos

NOTA: Os resultados representativos relatados foram obtidos com o fago Gordonia DelRio²¹, um bacteriófago de clima temperado isolado em G. terrae. Estes métodos também têm sido usados com sucesso com outros fagos de Gordonia .

1. Começando com um bacteriófago isolado, diluir em série a amostra de fago em tampão de fago⁷ para uma diluição de 1 x 10⁻⁸ . Realizar um ensaio de titulação de fago em ágar de dupla camada⁷ infectando 0,3 mL da cultura saturada de G. terrae com 10 μL de cada diluição do fago. Após uma incubação de 5-10 min à temperatura ambiente, combine a mistura de bactérias-fagos com 3 mL de ágar PYCa e despeje em placas de ágar PYCa.
2. Incubar as placas invertidas a 30 °C durante 3 dias ou até formar placas⁷.
3. Após a incubação, identifique uma "placa contável", uma placa com 20-200 placas. Contar o número de placas nessa placa e calcular unidades formadoras de placa por mililitro (pfu/mL)⁷.

3. Preparação de microplacas

NOTA: Microplacas de fundo plano de 96 poços (consulte a Tabela de Materiais) devem ser usadas para este método. Todo o preparo e carregamento da placa deve ser preenchido em um gabinete de biossegurança, devendo ser utilizadas boas práticas^{microbiológicas 17}.

1. Preparar a solução de revestimento antiembaçante da tampa combinando 100 μL de Triton-X 100, 40 mL de isopropanol a 100% e 160 mL de água deionizada²². Mexa para misturar e guarde à temperatura ambiente.
2. Em um gabinete de biossegurança, adicione 6 mL de solução de revestimento da tampa à superfície interna de uma tampa de microplaca estéril de 96 poços, segurando a tampa pelas bordas e girando-a para garantir que ela seja coberta pela solução. Deixe a solução descansar na tampa por 20 s, depois despeje a solução e inverta a tampa em um papel toalha autoclavado em um ângulo até que a tampa esteja completamente seca, o que normalmente leva de 35 a 45 minutos. Tenha cuidado para segurar a tampa pelas bordas.
3. Preparar 20 mL de agarose 0,1% em água para cada microplaca de 96 poços, microondulando para derreter a agarose.
4. Uma vez que a agarose tenha esfriado a 50-60 °C, pipetar 100 μL da agarose 0,1% em todos os espaços entre os poços da placa e 200 μL de agarose nos poços da linha A e da linha H e coluna 1, coluna 2, coluna 11 e coluna 12²³ (Figura 1).

4. Carregando a placa com bactérias e fagos

OBS: Todo o preparo e carregamento da placa deve ser preenchido em gabinete de biossegurança, devendo ser utilizadas as boas práticas^{microbiológicas 17} .

1. A placa de 96 poços conterá 75 μL de bactérias 2,0 x 10⁶ ufc/mL em cada poço⁹. Diluir a cultura bacteriana 4,0 x 10⁶ ufc/mL 1:1 com caldo 2x PYCa para 2,0 x 10⁶ ufc/mL. Preparar 5 mL por placa de 96 poços.
2. Diluir o lisado de fago usando tampão de fago 7 para fazer 1 mL cada de concentrações^de 2,0 x 10⁶ pfu/mL, 2,0 x 10⁵ pfu/mL e 2,0 x 10⁴ pfu/mL. Isso permitirá uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1, 0,1 e 0,01 dentro da microplaca⁹.
3. Para carregar a microplaca, pegue uma placa que foi preparada com solução antiembaçante e agarose, e pipete 75 μL da bactéria 2,0 x^{10 6} ufc/mL nas colunas 3-10, seguindo a Figura 1.
4. Na coluna 3 e na coluna 4, adicionar 75 μL de tampão fagológico estéril a cada poço para servir como controle positivo sem fago, seguindo a Figura 1, e pipetar para cima e para baixo para misturar após cada adição. Adicionar 75 μL do fago 2,0 x 10 6 pfu/mL à coluna 5 e à coluna⁶ , 75 μL do fago 2,0 x^{10 5} pfu/mL à coluna 7 e à coluna 8, e 75 μL do fago 2,0 x 10⁴ pfu/mL à coluna 9 e à coluna 10, pipetando para cima e para baixo para misturar após cada adição.
5. Fita adesiva de ambos os lados curtos da placa com fita de marcação de 0,5 para selar parcialmente a placa, permitindo a troca gasosa.

5. Medição de incubação e absorbância

1. Uma vez que as placas estejam carregadas com bactérias e fagos, coloque-as em um agitador de microplacas a 250 rpm e incube a 30 °C.
2. Incubar as placas por 96 h, fazendo uma medição de densidade óptica a 600 nm em um leitor de microplacas a cada 8 h a partir da hora 16. Retorne as placas ao agitador entre as medições.
   NOTA: Períodos de medição de 4, h 6 h, 8 h e 12 h foram avaliados, começando na hora 0, e determinou-se que um período de amostragem de 8 h começando em 16 h pós-infecção capturou melhor as interações Gordonia-fago.
3. Monitorar a tampa quanto à condensação durante todo o experimento. Se for observada condensação, substituir a tampa por outra tampa revestida de acordo com o passo 3.2.
4. Gere curvas de controle e crescimento infectado seguindo a seção 6 do protocolo.

6. Análise dos dados

1. Use um programa de planilha para calcular a média e o desvio padrão para cada diluição de fago, seguindo o layout da planilha no repositório Stacy-Ceballos-Index GitHub (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
2. Crie curvas de crescimento de controle e infectados e calcule métricas de infecção usando R (consulte a Tabela de Materiais) com os pacotes DescTools 24, dplyr 25, ggplot2²⁶ e readxl²⁷ e seguindo o script R no repositório Stacy-Ceballos-Index GitHub (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
   1. AUC_con é a área sob a curva de controle não infectado, enquanto AUC_inf é a área sob a curva infectada¹⁶. Calcule a AUC e, em seguida, calcule a inibição percentual do crescimento com base nos valores da área sob a curva, PI_AUC¹⁶, usando a seguinte equação:
      (1 - [AUC_inf/AUC_con]) × 100
   2. As linhas horizontais tracejadas em cada curva mostram o pico de crescimento, com o pico de crescimento não infectado marcado como N assíntota(con) e o pico de crescimento infectado marcado como_{N assíntota(inf).} Identifique os valores de N_assíntota e, em seguida, calcule a inibição percentual do crescimento com base nesses valores de pico de crescimento, PI_max¹⁶, usando a seguinte equação:
      (1 - [N assíntota(inf)/ N_{assíntota(con})]₎ × 100
   3. Calcular o índice de Stacy-Ceballos, I_SC¹⁶, a partir dos valores de PI_AUC e PI_max , da seguinte forma:
      (PI_AUC × PI_max) ^0,5
      Calcular a virulência relativa integrando o índice de Stacy-Ceballos ao longo do tempo¹⁶.

Discussion

Este método de microplaca baseado em densidade óptica permite investigar a gama de hospedeiros de bacteriófagos e a dinâmica da infecção¹¹ e mostra a utilidade do índice de Stacy-Ceballos¹⁶ como medida da virulência de bacteriófagos. Embora esse método possa ser utilizado com qualquer sistema bacteriófago-hospedeiro, ele foi projetado especificamente para adaptar ensaios de crescimento rápido em microplacas 9,10,11 para uso com bactérias de crescimento mais lento, como actinomicetos. Ensaios rápidos de microplacas não podem ser usados para bactérias de crescimento lento sem modificações para tratar a evaporação e a condensação da tampa. Este método descreve essas modificações necessárias e demonstra, pela primeira vez, o uso do índice de Stacy-Ceballos e métricas^{relacionadas16} para descrever a infecção por bacteriófagos.

A evaporação pode ser um desafio substancial em ensaios de curva de crescimento de placas de 96 poços de vários dias; Este método resolve esse problema adicionando agarose aos poços de borda e aos espaços entre os poços. A margem de agarose, combinada com o tratamento antiembaçante da tampa²², fornece a umidade necessária dentro da microplaca e permite medições confiáveis de densidade óptica. Sem a umidade adicionada, ocorre evaporação substancial do efeito de borda²³ durante o longo período de incubação necessário, levando a leituras de densidade óptica artificialmente altas. O tratamento antiembaçamento da tampa é uma modificação necessária, pois a condensação da tampa também pode elevar artificialmente os valores de densidade óptica. Agitar as placas durante o período de incubação é uma modificação recomendada, pois bactérias actinomicetas podem se aglomerar durante o crescimento, dando valores de densidade óptica artificialmente altos e efetivamente diminuindo a multiplicidade de infecção.

A proporção de bactérias/fagos em experimentos que caracterizam a dinâmica da infecção é crítica, pois deve haver fagos suficientes para mostrar um efeito de infecção, mas não tantos que a população bacteriana hospedeira caia imediatamente⁹ ou a frequência de lisogenia seja dramaticamente aumentada²⁸. Nesse método, a razão que se mostrou mais efetiva para a obtenção de resultados consistentes foi um MOI de 1, mas resultados utilizáveis também foram obtidos com MOIs de 0,1 e 0,01. Ao implementar este método, recomenda-se escolher uma concentração de bactérias e testar múltiplas concentrações de fagos na faixa de MOI de 0,01-1 9,10,11.

Essa técnica aqui descrita permite que as interações bacteriófagos-hospedeiro sejam avaliadas para bactérias de crescimento lento em ensaios de microplacas de alto rendimento, em vez de com subamostragem de um frasco de cultura maior em cada intervalo de medição²⁹. Além disso, ao demonstrar como os ensaios de crescimento em microplacas 9,10,11 podem ser adaptados, essa técnica aumenta a utilidade de outros ensaios de bacteriófagos baseados em microplacas para bactérias de crescimento mais lento, incluindo a caracterização do fago 5,6,12 e estudos de evolução ^30,31. Finalmente, este método demonstra o uso do índice de Stacy-Ceballos¹⁶ para descrever a infecção por bacteriófagos. Esta métrica foi inicialmente desenvolvida com dados de um sistema modelo de vírus archaeal e é calculada a partir de valores de densidade óptica, dando-lhe assim ampla utilidade em sistemas de vírus díspares.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Omni-Pur	2090	for filling border wells of microplate
Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch	Corning	3931	replacement microplate lid
Isopropanol	Fisher Chemical	A461-4	for lid coating
Microplate reader	Tecan Spark 20M
Microplate Shaker with 4-Place Platform	Thermo Fisher Scientific	88-861-023	to shake plates during incubation
Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well	Falcon (a Corning Brand)	351172	microplate for growth curve assay
Peptone yeast calcium (PYCa) agar	Homemade		1 g peptone 15 g yeast extract 15 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide
Peptone yeast calcium (PYCa) broth	Homemade, from Reference 16		1 g peptone 15 g yeast extract 990 mL dd H2O 4.5 ml 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide
Peptone yeast calcium (PYCa) top agar	Homemade		1 g peptone 15 g yeast extract 4 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose
Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	for determination of bacterial concentration and phage titer assay
Phage Buffer	Homemade, from Reference 7		10 mL 1 M Tris, pH 7.5 10 mL 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd H2O
R software	https://www.r-project.org/	version 4.3.0
Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure	Thermo Fisher Scientific	4116-1000	for bacterial culture
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	for lid coating