Адаптированный микропланшетный анализ на основе оптической плотности для характеристики инфекции актинобактериофагов

Summary

Описан метод микропланшетов на основе оптической плотности для количественной оценки долгосрочного роста бактерий в присутствии бактериофагов, подходящих для актиномицетов и других медленно растущих бактерий. Этот метод включает в себя модификации для уменьшения испарения и конденсации крышки, а также код R для расчета показателей вирусной инфекции, включая площадь под кривой, максимум роста и относительную вирулентность.

Abstract

Бактериофаги являются ключевой частью природной среды, и они обладают мощной способностью формировать бактериальные популяции. Чтобы понять, как отдельные фаги взаимодействуют с медленно растущими бактериальными хозяевами, такими как актиномицеты, необходим простой и надежный метод количественной оценки долгосрочного роста бактерий в присутствии фагов. Спектрофотометрические считыватели микропланшетов позволяют проводить высокопроизводительные повторные измерения, но инкубация небольшого объема в течение длительного времени может представлять технические проблемы. Эта процедура адаптирует стандартную 96-луночную микропланшет, чтобы обеспечить совместное культивирование фагов и бактерий без суботбора проб в течение 96 часов, при этом рост бактерий регистрируется каждые 8 часов с использованием спектрофотометрических значений поглощения. Эти значения оптической плотности анализируются с использованием R для получения показателей заражения, включая процентное ингибирование роста, относительную вирулентность и индекс Стейси-Себальоса. Методы, изложенные здесь, обеспечивают эффективный способ проведения и анализа экспериментов по кривой роста микропланшетов с увеличенной продолжительностью и включают модификации для уменьшения испарения и конденсации крышки. Эти протоколы облегчают микропланшетные анализы взаимодействия между медленно растущими бактериальными хозяевами и их бактериофагами.

Introduction

Бактериофаги или фаги — это вирусы, которые заражают бактерии. Они являются самыми многочисленными биологическими объектами на планете¹, и принято считать, что бактериофаги влияют на эволюцию бактерий и экосистемные процессы ^2,3,4. Существует несколько методов для описания, измерения и анализа бактериофага-хозяина 8 и динамики инфекции ^5,6, включая методы на основе агара, такие как метод^{двухслойного} агара 7 и методы микропланшетов на основе оптической плотности^8,9,10,11,12. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Благодаря своей эффективности испытания на покрытие с использованием метода двухслойного агара являются «золотым стандартом» для анализов диапазона хозяев, но этот метод требует много времени и труда⁹. Методы быстрых микропланшетов, которые возвращают результаты через 24 часа или меньше, дают отличные результаты для быстрорастущих бактериальных хозяев, таких как Escherichia coli 9,10,11,12, но слишком коротки, чтобы продемонстрировать прогрессирование бактериофагальной инфекции у медленно растущих бактериальных хозяев, таких как актиномицеты^7,13,14,15.

Микропланшетный анализ на основе оптической плотности, предназначенный для быстрорастущих бактерий, не может быть запущен в течение нескольких дней, необходимых для характеристики динамики инфекции в медленно растущей бактерии-хозяине, без испарения и создания искусственно высокой бактериальной плотности. Таким образом, получение сопоставимых высокопроизводительных данных о динамике бактериофаговой инфекции для медленно растущих видов бактерий требует специализированных методов, адаптированных для этих бактерий.

Представленный здесь метод микропланшетов уменьшает испарение, что позволяет культивировать медленно растущие бактерии совместно с фагом в течение длительного 96-часового периода и позволяет исследовать динамику фаговой инфекции и диапазон хозяев. Этот метод также демонстрирует индекс Стейси-Себальоса¹⁶, метрику на основе оптической плотности, которая позволяет сравнивать вирулентность между разрозненными вирусными системами-хозяевами.

Protocol

Хотя этот протокол написан для Gordonia terrae, он также успешно использовался для Gordonia lacunae, Gordonia rubripertincta и Gordonia westfalica.

1. Подготовка бактерий

1. В шкафу биобезопасности используйте надлежащую микробиологическую практику¹⁷ для инокуляции одной колонии Gordonia terrae CAG3 в стерильную передвижную колбу объемом 1 л 200 мл пептонного дрожжевого кальциевого бульона¹⁸ (PYCa), содержащего 0,01 мг / мл циклогексимида (см. Таблицу материалов).
2. Инкубируют колбу при 30 °C с встряхиванием при 250 об/мин до насыщения культуры или в течение 3 суток⁷.
3. Последовательно разбавляют насыщенную культуру G. terrae в бульоне PYCa и распределяют по 100 мкл каждого из 10−⁴, 10⁻⁵ и 10⁻⁶ разведений на пластинах PYCa^19,20. Охладите неразбавленную насыщенную культуру при температуре 4 °C.
4. Инкубируйте разложенные пластины в перевернутом виде в течение 3 дней при 30 °C.
5. После инкубации определите «счетную тарелку», тарелку с 20-200 колониями. Подсчитайте количество колоний на этой пластине и рассчитайте колониеобразующие единицы на миллилитр (КОЕ/мл)^19,20.
6. Разбавьте насыщенную культуру бульоном PYCa до 4,0 x 10⁶ КОЕ/мл бактерий.

2. Подготовка фагов

ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные результаты, о которых сообщалось, были получены с помощью фага Gordonia DelRio²¹, бактериофага умеренного пояса, выделенного на G. terrae. Эти методы также были успешно применены с другими фагами Gordonia .

1. Начиная с изолированного бактериофага, последовательно разбавляют образец фага в фаговом буфере⁷ до разведения 1 х 10⁻⁸ . Проведите двухслойный анализ титра фага^{агара 7} путем инфицирования 0,3 мл насыщенной культуры G. terrae 10 мкл каждого разведения фага. После 5-10-минутной инкубации при комнатной температуре смешайте смесь бактерий и фагов с 3 мл верхнего агара PYCa и вылейте на агаровые пластины PYCa.
2. Инкубируйте пластины, перевернутые при 30 ° C, в течение 3 дней или до образования^{бляшек 7}.
3. После инкубации определите «счетную тарелку», тарелку с 20-200 бляшками. Подсчитайте количество бляшек на этой пластине и рассчитайте количество единиц образования бляшек на миллилитр (БОЕ / мл)⁷.

3. Подготовка микропланшетов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого метода следует использовать плоскодонные 96-луночные микропланшеты (см. Таблицу материалов). Вся подготовка и загрузка пластин должны быть завершены в шкафу биобезопасности, и следует использовать надлежащую микробиологическую практику¹⁷.

1. Приготовьте раствор для покрытия крышки против запотевания, объединив 100 мкл Triton-X 100, 40 мл 100% изопропанола и 160 мл деионизированной воды²². Перемешайте и храните при комнатной температуре.
2. В шкафу биобезопасности добавьте 6 мл раствора для покрытия крышки на внутреннюю поверхность стерильной крышки микропланшета с 96 лунками, удерживая крышку за края и поворачивая ее, чтобы убедиться, что она покрыта раствором. Оставьте раствор на крышке на 20 с, затем слейте раствор и переверните крышку на автоклавное бумажное полотенце под углом, пока крышка полностью не высохнет, что обычно занимает 35-45 минут. Будьте осторожны, держите крышку за края.
3. Приготовьте 20 мл 0,1% агарозы в воде для каждой 96-луночной микропланшета, разогрев в микроволновой печи, чтобы растопить агарозу.
4. После того, как агароза остынет до 50-60 °C, пипетка 100 мкл 0,1% агарозы во все промежутки между лунками пластины и 200 мкл агарозы в лунки в ряду A и ряду H и столбце 1, столбце 2, столбце 11 и столбце 12²³ (рис. 1).

4. Загрузка пластины бактериями и фагами

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся подготовка и загрузка пластин должны производиться в шкафу биобезопасности, и следует использовать надлежащую микробиологическую практику¹⁷ .

1. Планшет на 96 лунок будет содержать 75 мкл бактерий размером 2,0 x 10^{6 КОЕ/}мл в каждой лунке⁹. Разбавьте бактериальную культуру 4,0 x 10 6 КОЕ/мл 1:1 2-кратным бульоном PYCa до 2,0 x 10,6^КОЕ/мл. Приготовьте 5 мл на 96-луночную тарелку.
2. Разбавьте лизат фага с помощью фагового буфера⁷ , чтобы получить по 1 мл концентраций 2,0 x 10⁶ БОЕ / мл, 2,0 x 10⁵ БОЕ / мл и 2,0 x 10⁴ БОЕ / мл. Это позволит получить кратность инфекции (MOI) 1, 0,1 и 0,01 в пределах микропланшета⁹.
3. Чтобы загрузить микропланшет, возьмите планшет, приготовленный с раствором антитумана и агарозой, и поместите 75 мкл бактерий размером 2,0 x 10^{6 КОЕ/} мл в колонки 3-10, как показано на рисунке 1.
4. В колонку 3 и колонку 4 добавьте 75 мкл стерильного фагового буфера в каждую лунку, чтобы он служил в качестве положительного контроля без фага, как показано на рисунке 1, и пипеткой вверх и вниз для смешивания после каждого добавления. Добавьте 75 мкл фага 2,0 x 10 6 БОЕ/мл в столбец 5 и столбец⁶ , 75 мкл фага 2,0 x 10⁵ КОЕ/мл в столбец 7 и столбец 8 и 75 мкл фага 2,0 x 10⁴ КОЕ/мл в колонку 9 и колонку 10, пипетку вверх и вниз для смешивания после каждого добавления.
5. Обклейте обе короткие стороны пластины этикетировочной лентой 0,5 дюйма, чтобы частично запечатать пластину и обеспечить газообмен.

5. Измерение инкубации и абсорбции

1. После того, как пластины загружены бактериями и фагами, поместите их в шейкер микропланшетов при 250 об/мин и инкубируйте при 30 °C.
2. Инкубируйте планшеты в течение 96 часов, измеряя оптическую плотность на длине волны 600 нм на считывателе микропланшетов каждые 8 часов, начиная с 16 часа. Возвращайте пластины в шейкер между измерениями.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Были оценены периоды измерения 4, ч 6 ч, 8 ч и 12 ч, начиная с часа 0, и было установлено, что 8-часовой период отбора проб, начинающийся через 16 ч после заражения, лучше всего отражает взаимодействие гордонии и фага.
3. Следите за конденсацией крышки на протяжении всего эксперимента. Если наблюдается конденсат, замените крышку другой крышкой с покрытием в соответствии с шагом 3.2.
4. Сгенерируйте контрольные и зараженные кривые роста в соответствии с разделом 6 протокола.

6. Анализ данных

1. Используйте программу для работы с электронными таблицами для расчета среднего значения и стандартного отклонения для каждого разведения фага в соответствии с макетом электронной таблицы в репозитории Stacy-Ceballos-Index GitHub (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
2. Создайте контрольные и зараженные кривые роста и вычислите метрики заражения с помощью R (см. Таблицу материалов) с пакетами DescTools 24, dplyr 25, ggplot2²⁶ и readxl²⁷ и следуя сценарию R в репозитории GitHub Stacy-Ceballos-Index (https://github.com/eichristenson/Stacy-Ceballos-Index).
   1. AUC_con — это площадь под неинфицированной контрольной кривой, а AUC_inf — площадь под инфицированной кривой¹⁶. Рассчитайте AUC, а затем рассчитайте процент ингибирования роста на основе площади под значениями кривой, PI_AUC¹⁶, используя следующее уравнение:
      (1 - [AUC_inf/AUC_con]) × 100
   2. Пунктирные горизонтальные линии на каждой кривой показывают пик роста, при этом неинфицированный пик роста помечен как N асимптота (con), а зараженный пик роста помечен как N_{асимптота (inf).} Определите значения_{N асимптот}, а затем рассчитайте процентное торможение роста на основе этих пиковых значений роста, PI_max¹⁶, используя следующее уравнение:
      (1 - [N асимптот(инф)/ N_{асимптот(кон})]₎ × 100
   3. Рассчитайте индекс Стейси-Себальоса, I_SC¹⁶, из значений PI_AUC и_{PI max} следующим образом:
      (PI_AUC ×_{PI max}) ^0,5
      Рассчитайте относительную вирулентность путем интегрирования индекса Стейси-Себальоса во времени¹⁶.

Discussion

Этот метод микропланшетов, основанный на оптической плотности, позволяет исследовать диапазон хозяев-бактериофагов и динамику инфекции¹¹ и показывает полезность индекса Стейси-Себальоса¹⁶ в качестве меры вирулентности бактериофага. Хотя этот метод может быть использован с любой системой бактериофаг-хозяин, он был разработан специально для адаптации анализов быстрого роста микропланшетов 9,10,11 для использования с медленно растущими бактериями^, такими как актиномицеты. Экспресс-анализы на микропланшетах не могут быть использованы для медленно растущих бактерий без модификаций, направленных на устранение испарения и конденсации крышки. Этот метод описывает эти необходимые модификации и впервые демонстрирует использование индекса Стейси-Себальоса и связанных с ним показателей¹⁶ для описания бактериофаговой инфекции.

Испарение может быть существенной проблемой при многодневных 96-луночных анализах кривой роста пластин; Этот метод решает эту проблему путем добавления агарозы в пограничные колодцы и промежутки между скважинами. Агарозный запас в сочетании с защитой от запотевания крышки²² обеспечивает необходимую влажность внутри микропланшета и позволяет надежно измерять оптическую плотность. Без дополнительной влажности существенное испарение с эффектом края происходит²³ в течение длительного инкубационного периода, что приводит к искусственно завышенным показаниям оптической плотности. Обработка крышки против запотевания является необходимой модификацией, поскольку конденсация крышки также может искусственно повышать значения оптической плотности. Встряхивание пластин в течение инкубационного периода является рекомендуемой модификацией, так как бактерии актиномицетов могут слипаться во время роста, давая искусственно высокие значения оптической плотности и эффективно уменьшая множественность инфекции.

Соотношение бактерий и фагов в экспериментах, характеризующих динамику инфекции, имеет решающее значение, так как фагов должно быть достаточно, чтобы показать эффект инфекции, но не настолько, чтобы популяция бактерий-хозяев немедленно упала⁹ или частота лизогении резко увеличилась²⁸. В этом методе соотношение, признанное наиболее эффективным для получения последовательных результатов, представляло MOI, равное 1, но пригодные для использования результаты также были получены с MOI 0,1 и 0,01. При реализации данного метода рекомендуется выбирать одну концентрацию бактерий и тестировать множественные концентрации фагов в диапазоне MOI 0,01-1 9,10,11.

Этот метод, описанный здесь, позволяет оценивать взаимодействия бактериофага и хозяина для медленно растущих бактерий в высокопроизводительных микропланшетных анализах, а не с помощью суботбора проб из более крупной колбы для культивирования на каждом интервале^{измерения 29}. Кроме того, демонстрируя, как могут быть адаптированы анализы роста^{микропланшетов} 9,10,11, этот метод увеличивает полезность других анализов бактериофагов на основе микропланшетов для медленно растущих бактерий, включая характеристику фагов ^5,6,12 и эволюционные исследования^30,31. Наконец, этот метод демонстрирует использование индекса Стейси-Себальоса¹⁶ для описания бактериофагальной инфекции. Эта метрика была первоначально разработана на основе данных из модельной системы архейных вирусов и рассчитывается на основе значений оптической плотности, что дает ей широкое применение в разрозненных вирусных системах.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Omni-Pur	2090	for filling border wells of microplate
Costar 96 Well Lid Low Evaporation Corner Notch	Corning	3931	replacement microplate lid
Isopropanol	Fisher Chemical	A461-4	for lid coating
Microplate reader	Tecan Spark 20M
Microplate Shaker with 4-Place Platform	Thermo Fisher Scientific	88-861-023	to shake plates during incubation
Non-Tissue Culture-Treated Plate 96 well	Falcon (a Corning Brand)	351172	microplate for growth curve assay
Peptone yeast calcium (PYCa) agar	Homemade		1 g peptone 15 g yeast extract 15 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide
Peptone yeast calcium (PYCa) broth	Homemade, from Reference 16		1 g peptone 15 g yeast extract 990 mL dd H2O 4.5 ml 1 M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose 1 mL 10 mg/mL cycloheximide
Peptone yeast calcium (PYCa) top agar	Homemade		1 g peptone 15 g yeast extract 4 g agar 990 mL dd H2O 4.5 mL 1M CaCl2 2.5 mL 40% dextrose
Petri plates	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	for determination of bacterial concentration and phage titer assay
Phage Buffer	Homemade, from Reference 7		10 mL 1 M Tris, pH 7.5 10 mL 1 M MgSO4 4 g NaCl 980 ml dd H2O
R software	https://www.r-project.org/	version 4.3.0
Sterile Disposable PETG Flask Baffled Bottom w/Vented Closure	Thermo Fisher Scientific	4116-1000	for bacterial culture
Triton X-100	Sigma Aldrich	9036-19-5	for lid coating