이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회(NSERC) 보조금 번호 RGPIN-2020-06111과 Brad Lace의 관대한 기부로 자금을 지원받았습니다. K599 아그로박테리움 및 예비 프로토콜에 대해 Wayne Parrott (University of Georgia)에, pGWB2, pGWB6 및 pANDA35HK 빈 벡터에 대해 Nakagawa & Hachiya 연구실 (Shimane University)에 감사드립니다.

알림: 모든 진행 단계는 무균 상태에서 수행하는 것이 좋습니다.
1. 콩 종자 살균
<ol><li>생물 안전 캐비닛에 16-20개의 둥근 Williams 82 대두 종자를 50mL 원심분리기 튜브에 깨끗한 상태(즉, 균열이나 흠집 없음)로 넣습니다.</li>
	<li>70% 이소프로필 알코올 30mL를 넣고 30초 동안 부드럽게 흔든 다음 알코올을 디캔팅합니다.</li>
	<li>씨앗을 10% 표백제 30mL로 10초 동안 부드?...

형질전환 대두 털 뿌리의 고효율 생산

<ol>
	<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transformation+in+soybean.">Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 246 (2017).</li><li>Elhady, A., Hallmann, J., Heuer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiosis+of+soybean+with+nitrogen+fixing+bacteria+affected+by+root+lesion+nematodes+in+a+density-dependent+manner.">Symbiosis of soybean with nitrogen fixing bacteria affected by root lesion nematodes in a density-dependent manner.</a> Scientific Reports. 10, 1619 (2020).</li><li>Huang, X. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhizosphere+interactions:+root+exudates,+microbes,+and+microbial+communities.">Rhizosphere interactions: root exudates, microbes, and microbial communities.</a> Botany. 92 (4), 267-275 (2014).</li><li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+genetic+transformation+and+applications+in+citrus.">Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation and applications in citrus.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 1039094 (2022).</li><li>Hwang, H. -. H., Yu, M., Lai, E. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-mediated+plant+transformation:+biology+and+applications.">Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications.</a> The Arabidopsis Book. 15, e0186 (2017).</li><li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+cultures-a+versatile+tool+with+multiple+applications.">Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).</li><li>Ono, N. N., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiplicity+of+hairy+root+cultures:+prolific+possibilities.">The multiplicity of hairy root cultures: prolific possibilities.</a> Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).</li><li>Kereszt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+soybean+to+study+root+biology.">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology.</a> Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soybean+hairy+roots+produced+in+vitro+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation.">Soybean hairy roots produced in vitro by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> The Crop Journal. 6 (2), 162-171 (2018).</li><li>Song, J., T&#243;th, K., Montes-Luz, B., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soybean+hairy+root+transformation:+a+rapid+and+highly+efficient+method.">Soybean hairy root transformation: a rapid and highly efficient method.</a> Current Protocols. 1 (7), e195 (2021).</li><li>Fattahi, F., Shojaeiyan, A., Palazon, J., Moyano, E., Torras-Claveria, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methyl-&#946;-cyclodextrin+and+coronatine+as+new+elicitors+of+tropane+alkaloid+biosynthesis+in+Atropa+acuminata+and+Atropa+belladonna+hairy+root+cultures.">Methyl-&#946;-cyclodextrin and coronatine as new elicitors of tropane alkaloid biosynthesis in Atropa acuminata and Atropa belladonna hairy root cultures.</a> Physiologia Plantarum. 172 (4), 2098-2111 (2021).</li><li>Farrell, K., Jahan, M., Kovinich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+of+biotic+and+chemical+elicitors+enable+additive+elicitation+of+the+anticancer+Phytoalexin+Glyceollin+I.">Distinct mechanisms of biotic and chemical elicitors enable additive elicitation of the anticancer Phytoalexin Glyceollin I.</a> Molecules. 22 (8), 1261 (2017).</li><li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+hairy+root+transformation+for+gene+functional+and+gene+editing+analysis+in+soybean.">Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation for gene functional and gene editing analysis in soybean.</a> Plant Methods. 17 (1), 73 (2021).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> Plant Cell. 32 (11), 3388-3407 (2020).</li><li>Gomes, C., Dupas, A., Pagano, A., Grima-Pettenati, J., Paiva, J. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+transformation:+a+useful+tool+to+explore+gene+function+and+expression+in+Salix+spp.+recalcitrant+to+transformation.">Hairy root transformation: a useful tool to explore gene function and expression in Salix spp. recalcitrant to transformation.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1427 (2019).</li><li>Ahmed, S., Kovinich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phytoalexin+biosynthesis+for+agriculture+and+human+health.">Regulation of phytoalexin biosynthesis for agriculture and human health.</a> Phytochemistry Reviews. 20, 483-505 (2021).</li><li>Walker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceollins+trigger+anti-proliferative+effects+in+hormone-dependent+aromatase-inhibitor-resistant+breast+cancer+cells+through+the+induction+of+apoptosis.">Glyceollins trigger anti-proliferative effects in hormone-dependent aromatase-inhibitor-resistant breast cancer cells through the induction of apoptosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (5), 2887 (2022).</li><li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+genome+sequence+of+cucumopine-type+Agrobacterium+rhizogenes+strain+K599+(NCPPB2659),+a+nature's+genetic+engineer+inducing+hairy+roots.">The complete genome sequence of cucumopine-type Agrobacterium rhizogenes strain K599 (NCPPB2659), a nature's genetic engineer inducing hairy roots.</a> International Journal of Agriculture Biology. 20 (5), 1167-1174 (2018).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+dissects+incomplete+activation+of+phytoalexin+biosynthesis+by+the+soybean+transcription+factors+GmMYB29A2+and+GmNAC42-1.">RNA-Seq dissects incomplete activation of phytoalexin biosynthesis by the soybean transcription factors GmMYB29A2 and GmNAC42-1.</a> Plants. 12 (3), 545 (2023).</li><li>Jahan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyceollin+transcription+factor+GmMYB29A2+regulates+soybean+resistance+to+Phytophthora+sojae.">Glyceollin transcription factor GmMYB29A2 regulates soybean resistance to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiology. 183 (2), 530-546 (2020).</li><li>Jahan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAC+family+transcription+factor+GmNAC42-1+regulates+biosynthesis+of+the+anticancer+and+neuroprotective+glyceollins+in+soybean.">The NAC family transcription factor GmNAC42-1 regulates biosynthesis of the anticancer and neuroprotective glyceollins in soybean.</a> BMC Genomics. 20, 149 (2019).</li><li>Nguyen, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+uricase+and+xanthine+dehydrogenase+in+soybean+nitrogen+fixation+and+nodule+development.">Critical role for uricase and xanthine dehydrogenase in soybean nitrogen fixation and nodule development.</a> The Plant Genome. , e20171 (2021).</li><li>Brear, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GmVTL1a+is+an+iron+transporter+on+the+symbiosome+membrane+of+soybean+with+an+important+role+in+nitrogen+fixation.">GmVTL1a is an iron transporter on the symbiosome membrane of soybean with an important role in nitrogen fixation.</a> New Phytologist. 228 (2), 667-681 (2020).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+transcription+factor+GmTGA15+enhances+drought+tolerance+in+transgenic+soybean+hairy+roots+and+Arabidopsis+plants.">Overexpression of transcription factor GmTGA15 enhances drought tolerance in transgenic soybean hairy roots and Arabidopsis plants.</a> Agronomy. 11 (1), 170 (2021).</li><li>Savka, M., Ravillion, B., Noel, G., Farrand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+hairy+roots+on+cultivated+soybean+genotypes+and+their+use+to+propagate+the+soybean+cyst+nematode.">Induction of hairy roots on cultivated soybean genotypes and their use to propagate the soybean cyst nematode.</a> Phytopathology. 80 (5), 503-508 (1990).</li><li>Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+of+soybean+isoflavone+synthase+genes+leads+to+silencing+in+tissues+distal+to+the+transformation+site+and+to+enhanced+susceptibility+to+Phytophthora+sojae.">RNA interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in tissues distal to the transformation site and to enhanced susceptibility to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiology. 137 (4), 1345-1353 (2005).</li><li>Sharma, A. R., Gajurel, G., Ahmed, I., Roedel, K., Medina-Bolivar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+prenylated+stilbenoids+arachidin-1+and+arachidin-3+and+their+semi-preparative+separation+and+purification+from+hairy+root+cultures+of+peanut+(Arachis+hypogaea+l.).">Induction of the prenylated stilbenoids arachidin-1 and arachidin-3 and their semi-preparative separation and purification from hairy root cultures of peanut (Arachis hypogaea l.).</a> Molecules. 27 (18), 6118 (2022).</li><li>Lozovaya, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoflavonoid+accumulation+in+soybean+hairy+roots+upon+treatment+with+Fusarium+solani.">Isoflavonoid accumulation in soybean hairy roots upon treatment with Fusarium solani.</a> Plant Physiology Biochemistry. 42 (7-8), 671-679 (2004).</li><li>Rahimi Khonakdari, M., Rezadoost, H., Heydari, R., Mirjalili, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+photoperiod+and+plant+growth+regulators+on+in+vitro+mass+bulblet+proliferation+of+Narcissus+tazzeta+L.+(Amaryllidaceae),+a+potential+source+of+galantamine.">Effect of photoperiod and plant growth regulators on in vitro mass bulblet proliferation of Narcissus tazzeta L. (Amaryllidaceae), a potential source of galantamine.</a> Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 142 (1), 187-199 (2020).</li></ol>

지난 10년 동안 대두 HR 방법은 질소 고정 22,23, 생물학적 및 비생물적 스트레스 내성 24,25, 대사 산물 생합성 경로 26,27에 관여하는 유전자를 연구하는 강력한 도구로 개발되었습니다. 식물이 대사 산물을 생산하는 방법에 대한 지식은 병원체에 대한 생화학적 방어를...

대두(Glycine max)는 농업에서 가장 가치 있는 작물 중 하나입니다. 그것은 식품, 동물 사료, 기름과 같은 수천 개의 상업 및 산업 용도를 가지고 있으며 제조 원료의 원천으로사용됩니다 1. 질소 고정 토양 미생물, 즉 근경(rhizobia)과 공생 관계를 형성하는 능력은 대두 유전학 연구의 중요성을 더욱 높인다2. 예를 들어, 콩 뿌리의 질소 고정 특성을 미세 조정하면 탄소 배출량을 줄이고 질소 비료에 대한 요구량을 크게 줄일 수 있습니다3. 따라서 특히 콩 뿌리 생물학의 측면을 제어하는 유전학을 이해하는 것은 농업과 산업 분야에서 광범위하게 응용됩니다. 이러한 이점을 고려할 때 대두 유전자의 기능을 분석하기 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 갖는 것이 중요합니다.
Agrobacterium tumefaciens는 많은 식물 종의 핵 게놈에 전달 DNA(T-DNA)를 통합할 수 있는 능력이 있기 때문에 식물 유전자 변형에 가장 일반적으로 사용되는 도구일 것입니다. 아그로박테리움이 식물을 감염시키면 종양 유도(Ti) 플라스미드를 숙주 염색체로 전달하여 감염 부위에 종양을 형성합니다. 아그로박테리움 매개 형질전환은 유전자 기능 분석과 작물 형질을 변형시키기 위해 수십 년 동안 널리 사용되어 왔다4. 관심 있는 모든 유전자는 A. tumefaciens 매개 형질전환을 통해 숙주 식물 세포로 쉽게 전달될 수 있지만 이 방법에는 몇 가지 단점이 있습니다. 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 대두와 같은 많은 식물 종에 대한 광범위한 전문 지식이 필요합니다. A. tumefaciens를 이용한 자엽 결절 접근법으로 몇 가지 종류의 대두를 형질전환시킬 수 있지만, 이 접근법의 비효율성으로 인해 신속하고 효율적인 대체 유전자 변형 기술이 필요합니다 4,5. 비전문가도 이러한 단점을 극복하기 위해 이 아그로박테리움 뿌리 유전자 매개 털뿌리(HR) 형질전환 방법을 사용할 수 있습니다.
HR 변환은 유전자 기능 분석뿐만 아니라 특수 대사 산물 및 정밀 화학 물질, 복잡한 생리 활성 당단백질 생산과 같은 생명 공학 응용 분야에도 비교적 빠른 도구입니다6. 대두 HR의 생산은 자엽의 표면에 상처를 입힌 후 아그로박테리움 리조제네스(Agrobacterium rhizogenes)를 접종함으로써 생성될 수 있기 때문에 광범위한 전문 지식을 필요로 하지 않는다 7. A. rhizogenes는 이소성 뿌리 성장을 자극하는 동시에 T-DNA 세그먼트를 식물 세포의 게놈으로 전달, 운반 및 통합하는 Ti 플라스미드에 의해 암호화된 독성(Vir) 유전자를 발현합니다8.
조직, 세포 및 장기 배양의 생물학적 또는 A. tumefaciens 기반 형질전환과 같은 다른 대두 유전자 발현 시스템과 비교하여 HR 발현 시스템은 몇 가지 이점을 나타냅니다. 첫째, HR은 유전적으로 안정적이며 호르몬이 없는 배지에서 빠르게 생산된다 1,9,10. 또한, HR은 천연 뿌리11,12와 동등하거나 그 이상의 양으로 특수 대사 산물을 생산할 수 있습니다. 이러한 장점으로 인해 HR은 A. tumefaciens와 양립할 수 없거나 양립할 수 있는 조직을 형성하기 위해 특별한 조직 배양 조건이 필요한 식물 종에 적합한 생명공학 도구입니다. HR 방법은 RNA 시퀀싱을 사용하여 단백질-단백질 상호 작용, 단백질 세포 내 국소화, 재조합 단백질 생산, 식물 정화, 돌연변이 유발 및 게놈 전체 효과를 분석하기 위한 효율적인 접근 방식입니다13,14,15. 또한 중요한 미생물 병원균인 Phytophthora sojae에 대한 대두의 방어를 촉진하고 인간에게 인상적인 항암 및 신경 보호 활성을 갖는 글리세올린을 포함하여 업계에서 가치가 있는 특수 대사 산물의 생산을 연구하는 데 사용할 수 있습니다16,17.
이 보고서는 대두 HR을 생산하기 위한 쉽고 효율적인 프로토콜을 보여줍니다. 이전 HR 형질전환 방법과 비교하여 이 프로토콜은 대두 자엽을 접종하기 전에 Ti 플라스미드의 존재에 대해 A. rhizogenes 형질전환체를 사전 스크리닝하여 HR 형성 속도에서 유의한(33%-50%) 개선을 제공합니다. 우리는 대두 전사 인자 유전자를 과발현하거나 침묵시키는 여러 이진 벡터를 변형하여 이 프로토콜의 적용 가능성을 입증합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acetosyringone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>23224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>lavo</td>
			<td>21124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>195679</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelzan</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>HYY3251089A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>HHA0397050B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>206462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>SQS0378007G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB powder</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>200318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS powder</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>2210001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>194171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>192946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-757-11</td>
			<td>100 mm x 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphinothricin</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>P034-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REDExtract-N-Amp PCR Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R4775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>2D76475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timentin</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>12222002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamins</td>
			<td>Caisson labs</td>
			<td>2211010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

soybean hairy root transformation for the analysis of gene function

대두(Glycine max)는 수천 가지 산업적 용도를 가진 농업에서 귀중한 작물입니다. 콩 뿌리는 질소와 병원균을 고정하기 위해 공생을 형성하는 토양 매개 미생물과의 주요 상호 작용 부위이며, 이는 농업 생산을 개선하기 위해 콩 뿌리 유전학과 관련된 연구를 가장 중요하게 만듭니다. 대두 털 뿌리(HR)의 유전적 변형은 Agrobacterium rhizogenes 균주 NCPPB2659(K599)에 의해 매개되며 처음부터 끝까지 단 2개월이 소요되는 대두 뿌리의 유전자 기능을 연구하는 데 효율적인 도구입니다. 여기에서 우리는 대두 HR에서 관심 유전자를 과발현하고 침묵시키는 방법을 설명하는 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 방법론에는 대두 종자 살균, 자엽의 K599 감염, RNA 분리를 위한 유전자 변형 HR의 선택 및 수확, 그리고 필요한 경우 대사산물 분석이 포함됩니다. 이 접근법의 처리량은 여러 유전자 또는 네트워크를 동시에 연구하기에 충분하며 장기적으로 안정적인 형질전환 접근법을 도입하기 전에 최적의 엔지니어링 전략을 결정할 수 있습니다.

Soybean (Glycine max) is among the most valuable crops in agriculture. It has thousands of commercial and industrial uses, such as food, animal feed, oil, and as a source of raw materials for manufacturing1. Its ability to form a symbiotic relationship with nitrogen-fixing soil microorganisms, namely rhizobia, further elevates the importance of studying soybean genetics2. For instance, fine-tuning nitrogen fixation properties in soybean roots can lead to the reduction of carbon emissions and greatly reduce requirements for nitrogen fertilizer3. Thus, understanding the genetics that controls aspects of soybean root biology, in particular, has wide applications in agriculture and industry. Considering these benefits, it is important to have a reliable protocol to analyze the function of soybean genes.
Agrobacterium tumefaciens is perhaps the most commonly used tool for plant genetic transformation as it has the capability of integrating transfer DNA (T-DNA) into the nuclear genome of many plant species. When Agrobacterium infects a plant, it transfers the tumor-inducing (Ti) plasmid into the host chromosome, leading to the formation of a tumor at the infection site. The Agrobacterium-mediated transformation has been widely used for decades for gene functional analysis and in order to modify crop traits4. Although any gene of interest can be readily transferred into host plant cells through A. tumefaciens-mediated transformation, this method has several drawbacks; it is time-consuming, expensive, and requires extensive expertise for many plant species, such as soybean. Although a few varieties of soybean can be transformed by the cotyledonary node approach using A. tumefaciens, the inefficiency of this approach necessitates the need for an alternative genetic transformation technology that is rapid and highly efficient4,5. Even a non-expert can use this Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root (HR) transformation method to overcome these disadvantages.
HR transformation is a relatively fast tool, not only for analyzing gene function, but also for biotechnological applications, such as the production of specialized metabolites and fine chemicals, and complex bioactive glycoproteins6. The production of soybean HRs does not require extensive expertise, as they can be generated by wounding the surfaces of cotyledons, followed by inoculation with Agrobacterium rhizogenes7. A. rhizogenes expresses virulence (Vir) genes encoded by its Ti plasmid that transfer, carry, and integrate its T-DNA segment into the genome of plant cells while simultaneously stimulating ectopic root growth8.
Compared to other soybean gene&#160;expression systems, such as biolistics or A. tumefaciens-based transformation of tissue, cell, and organ culture, the HR expression system exhibits several advantages. Firstly, HRs are genetically stable and produced quickly on hormone-free media1,9,10. Additionally, HRs can produce specialized metabolites in amounts equivalent to or greater than native roots11,12. These advantages make HRs a desirable biotechnological tool for plant species that are incompatible with A. tumefaciens or that require special tissue culture conditions to form compatible tissues. The HR method is an efficient approach for analyzing protein-protein interactions, protein subcellular localization, recombinant protein production, phytoremediation, mutagenesis, and genome wide effects using RNA sequencing13,14,15. It can also be used to study the production of specialized metabolites that have value in the industry, including glyceollins, which medicate soybean&#39;s defense against the important microbial pathogen Phytophthora sojae and have impressive anticancer and neuroprotective activities in humans16,17.
This report demonstrates an easy, efficient protocol to produce soybean HRs. Compared to previous HR transformation methods, this protocol provides a significant (33%-50%) improvement in the rate of HR formation by prescreening A. rhizogenes transformants for the presence of the Ti plasmid prior to inoculating soybean cotyledons. We demonstrate the applicability of this protocol by transforming several binary vectors that overexpress or silence soybean transcription factor genes.

저자 스포트라이트: 유전자 기능 분석을 위한 대두 털 뿌리 형질전환  

유전자 기능 분석을 위한 콩 털이 뿌리 형질전환

Our soybean hairy root transformation method is sufficient to simultaneously study the functions of several genes or networks, and could determine the optimal engineering strategies prior to committing to long-term stable transformation approaches. Soybean hairy root transformation is a useful tool for the analysis of gene function in soybean plants. The technology that are currently used, include CRISPR-Cas9 genome editing, RNA interference, transcriptomics and proteomics, and imaging technologies.The major challenge in the model era of functional genomics is sufficient analyzing the function of numerous genes. Most genes are polygenic, being achieved by the interaction of many genes. Our hairy root protocol will facilitate gene function analysis with sufficient throughput, so that polygenic networks can begin to be understood.We have established the importance of the Ti plasmid in agrobacterium rhizogene strains. We found that without screening for the Ti plasmid, it increased the risk for the transformed soybean cotyledon, to fail to produce any colors. As a result, screening for the plasmid became a vital step before the transformation.Compared to other gene expression techniques, our hair root expression system is easy to handle, less time consuming, and cost effective. Also, our new protocol has improved hairy root transformation rate up to 50%by checking for the Ti plasmid and agrobacterium prior to cotyledon transformation. By characterizing the function of more than a dozen transcription factor genes, our recent results have paved the way for multi-gene engineering studies, aimed at unlocking the biosynthesis of valuable phytoalexin metabolites in plants.In the future, we will use this hairy root transformation method to dissect the transcription factor gene networks that regulate the biosynthesis of phytoalexins. The approach could be used to enhance the production of these specialized metabolites for pharmaceutical and agricultural industries.

대표적인 결과는 발표 된 데이터19,20에서 나온 것입니다. 형질전환된 K599 아그로박테리움의 콜로니 PCR(cPCR) 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 양성 콜로니에 의해 나타난 바와 같이, 관심있는 유전자는 cPCR에 의해 검출되었다 (도 1A). 그러나 콜로니의 1/3 내지 1/2은 VirD2 유...

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여기에서 우리는 형질전환 대두 털 뿌리의 고효율 생산을 위한 프로토콜을 제시합니다.

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with ...

우리의 콩털 뿌리 형질전환 방법은 여러 유전자 또는 네트워크의 기능을 동시에 연구하기에 충분하며 장기적으로 안정적인 형질전환 접근법을 사용하기 전에 최적의 엔지니어링 전략을 결정할 수 있습니다. 콩 털이 많은 뿌리 형질전환은 콩 식물의 유전자 기능 분석에 유용한 도구입니다. 현재 사용되는 기술로는 CRISPR-Cas9 게놈 편집, RNA 간섭, 전사체학 및 단백질체학, 이미징 기술 등이 있습니다.기능유전체학의 모델 시대의 주요 과제는 수많은 유전자의 기능을 분석하는 것만으로도 충분하다. 대부분의 유전자는 다원성이며 많은 유전자의 상호 작용에 의해 달성됩니다. 우리의 털이 많은 뿌리 프로토콜은 충분한 처리량으로 유전자 기능 분석을 용이하게 하여 다유전자 네트워크를 이해하기 시작할 수 있습니다.우리는 아그로박테리움 리조겐 균주에서 Ti 플라스미드의 중요성을 확립했습니다. 우리는 Ti 플라스미드에 대한 스크리닝 없이 형질전환된 대두 자엽이 어떤 색도 생성하지 못할 위험을 증가시킨다는 것을 발견했습니다. 그 결과, 플라스미드에 대한 스크리닝은 형질전환 전에 중요한 단계가 되었습니다.다른 유전자 발현 기술에 비해 당사의 모근 발현 시스템은 다루기 쉽고 시간이 덜 걸리며 비용 효율적입니다. 또한, 우리의 새로운 프로토콜은 자엽 형질전환 전에 Ti 플라스미드와 아그로박테리움을 확인하여 털이 많은 뿌리 형질전환율을 최대 50%까지 향상시켰습니다. 12개 이상의 전사 인자 유전자의 기능을 특성화함으로써, 우리의 최근 결과는 식물에서 귀중한 파이토알렉신 대사 산물의 생합성을 잠금 해제하는 것을 목표로 하는 다중 유전자 공학 연구의 길을 열었습니다.앞으로 우리는 이 털이 많은 뿌리 형질전환 방법을 사용하여 파이토알렉신의 생합성을 조절하는 전사 인자 유전자 네트워크를 해부할 것입니다. 이 접근법은 제약 및 농업 산업을 위한 이러한 특수 대사 산물의 생산을 향상시키는 데 사용될 수 있습니다.

유전자 기능 분석을 위한 콩 털이 뿌리 형질전환

Abstract