Transformação de raízes pilosas de soja para análise da função gênica

Summary

Apresentamos um protocolo para a produção de raízes pilosas de soja transgênica de alta eficiência.

Abstract

A soja (Glycine max) é uma cultura valiosa na agricultura que tem milhares de usos industriais. As raízes de soja são o principal sítio de interação com micróbios de solo que formam simbiose para fixar nitrogênio e patógenos, o que torna as pesquisas envolvendo genética de raízes de soja de importância primordial para melhorar sua produção agrícola. A transformação genética de raízes pilosas (HRs) de soja é mediada pela linhagem Agrobacterium rhizogenes NCPPB2659 (K599) e é uma ferramenta eficiente para estudar a função gênica em raízes de soja, levando apenas 2 meses do início ao fim. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado que descreve o método para superexpressar e silenciar um gene de interesse em HRs de soja. Essa metodologia inclui a esterilização de sementes de soja, a infecção de cotilédones com K599 e a seleção e colheita de HRs geneticamente transformados para isolamento de RNA e, se necessário, análises de metabólitos. O rendimento da abordagem é suficiente para estudar simultaneamente vários genes ou redes e pode determinar as estratégias de engenharia ótimas antes de se comprometer com abordagens de transformação estável de longo prazo.

Introduction

A soja (Glycine max) está entre as culturas mais valiosas na agricultura. Possui milhares de usos comerciais e industriais, como alimentos, ração animal, óleo e como fonte de matéria-prima para a fabricação¹. Sua capacidade de formar uma relação simbiótica com microrganismos fixadores de nitrogênio do solo, nomeadamente rizóbios, eleva ainda mais a importância do estudo da genética da^soja2. Por exemplo, o ajuste fino das propriedades de fixação de nitrogênio em raízes de soja pode levar à redução das emissões de carbono e reduzir significativamente as necessidades de fertilizantes nitrogenados^3....

Protocol

NOTA: Recomenda-se que todas as etapas do processo sejam conduzidas em condições estéreis.

1. Esterilização de sementes de soja

1. Em um gabinete de biossegurança, coloque 16-20 sementes redondas de soja Williams 82 em estado puro (ou seja, sem rachaduras ou manchas) em um tubo de centrífuga de 50 mL.
2. Adicione 30 mL de álcool isopropílico a 70%, agite suavemente por 30 s e, em seguida, decante o álcool.
3. Agitar suavemente as sementes com 30 .......

Discussion

Durante a última década, o método HR da soja tem sido desenvolvido como uma poderosa ferramenta para estudar genes envolvidos na fixação de nitrogênio 22,23, tolerância ao estresse biótico e abiótico 24,25 e vias biossintéticas de metabólitos ^26,27. O conhecimento de como as plantas produzem metabólitos traz uma infinidade de benefíci.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetosyringone	Cayman	23224
Bleach	lavo	21124
DMSO	Fisher bioreagents	195679
Gelzan	Phytotech	HYY3251089A
Hygromycin	Phytotech	HHA0397050B
Isopropyl alcohol	Fisher chemical	206462
Kanamycin	Phytotech	SQS0378007G
LB powder	Fisher bioreagents	200318
MS powder	Caisson labs	2210001
Na2HPO4	Fisher bioreagents	194171
NaCl	Fisher chemical	192946
Petri dishes	Fisherbrand	08-757-11	100 mm x 25 mm
Phosphinothricin	Cedarlane	P034-250MG
REDExtract-N-Amp PCR Kit	Sigma	R4775
Sucrose	Bioshop	2D76475
Timentin	Caisson labs	12222002
Vitamins	Caisson labs	2211010