Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מפרט את תהליך הייצור של תאי T קולטני אנטיגן כימריים לשימוש קליני, במיוחד באמצעות מעבד תאים אוטומטי המסוגל לבצע התמרה נגיפית וטיפוח של תאי T. אנו מספקים המלצות ומתארים מלכודות שיש לקחת בחשבון במהלך תהליך הפיתוח והיישום של ניסוי קליני בשלב מוקדם.

Abstract

תאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T מייצגים גישה אימונותרפית מבטיחה לטיפול במחלות ממאירות ולא ממאירות שונות. תאי CAR-T הם תאי T מהונדסים גנטית המבטאים חלבון כימרי המזהה ונקשר למטרה על פני התא, וכתוצאה מכך הורג את תא המטרה. שיטות ייצור מסורתיות של תאי CAR-T הן עתירות עבודה, יקרות ועלולות לשאת סיכון לזיהום. CliniMACS Prodigy, מעבד תאים אוטומטי, מאפשר לייצר מוצרי תרפיה תאית בקנה מידה קליני במערכת סגורה, תוך מזעור הסיכון לזיהום. העיבוד מתבצע באופן חצי אוטומטי בשליטת המחשב ובכך ממזער את המעורבות האנושית בתהליך, מה שחוסך זמן ומפחית שונות ושגיאות.

כתב יד וסרטון זה מתאר את תהליך התמרת תאי T (TCT) לייצור תאי CAR-T באמצעות מעבד זה. תהליך ה-TCT כולל העשרה, הפעלה והעברה של תאי T מסוג CD4+/CD8+, התמרה באמצעות וקטור נגיפי, הרחבה וקציר. באמצעות מטריצת הפעילות, פונקציונליות המאפשרת הזמנה ותזמון של שלבים אלה, ניתן להתאים אישית את תהליך TCT באופן נרחב. אנו מספקים הדרכה על ייצור תאי CAR-T בהתאם לתנאי ייצור נאותים (cGMP) הנוכחיים ודנים בבדיקות שחרור נדרשות ובניסויים פרה-קליניים שיתמכו ביישום תרופה ניסיונית חדשה (IND). אנו מדגימים את ההיתכנות ודנים ביתרונות ובחסרונות של שימוש בתהליך חצי אוטומטי לייצור תאי CAR-T קליניים. לבסוף, אנו מתארים ניסוי קליני מתמשך ביוזמת חוקר המתמקד בממאירויות של תאי B בילדים [NCT05480449] כדוגמה לאופן שבו תהליך ייצור זה יכול להיות מיושם בסביבה קלינית.

Introduction

העברה מאומצת של תאי T שהונדסו לבטא קולטן אנטיגן כימרי (CAR) הראתה יעילות יוצאת דופן בטיפול בחולים עם ממאירויות עקשניות של תאי B 1,2,3,4,5. עם זאת, שיטות הייצור המסורתיות של תאי CAR-T הן עתירות עבודה, גוזלות זמן רב, ודורשות טכנאים מיומנים מאוד לביצוע צעדים מיוחדים ביותר. לדוגמה, תהליך הייצור המסורתי של מוצר תאי CAR-T אוטולוגי כולל צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, אלוטריזציה או הפרדה מגנטית להעשרת תאי T, הפעלה והתמרה עם וקטור נגיפי בצלוחית סטרילית, והתפשטות בביוריאקטור לפני הקציר והפורמולציה. לאחרונה צצו מערכות ש....

Protocol

כל המחקר בוצע בהתאם להנחיות המוסדיות ובאישור ועדת הביקורת המוסדית של בית החולים (IRB), וכל הנבדקים נתנו הסכמה מדעת לפרסום הנתונים שנאספו במסגרת הניסוי.
הערה: החלק הראשון של הפרוטוקול מספק סקירה ברמה גבוהה של תהליך הייצור של CAR-T. שאר הסעיפים מספקים את ההוראות שלב אחר שלב. הפרוטוקול מתאר את ז.......

Representative Results

תוצאות משלוש ריצות הייצור הראשונות של CAR-T בניסוי NCT05480449 מוצגות להלן בטבלה 3. חומר המוצא, וקטור, ציטוקינים בתרבית וריכוזי AB בסרום נשמרו עקביים בכל ריצה. המוצרים נקטפו ביום 7 או 8. צמיחת התאים היומית הממוצעת הייתה 46% (עלייה בספירת התאים הכוללת), מה שמצביע על כך שתהליך ה-TCT היה יעיל בקידום.......

Discussion

טיפול בתאי CAR-T התגלה כגישה טיפולית מבטיחה עבור תאי B וממאירויות אחרות. עם זאת, לשיטות ייצור מסורתיות של תאי CAR-T יש מספר מגבלות, כגון עלות גבוהה, ייצור עתיר עבודה וצעדים פתוחים המגבירים את הסיכון לזיהום. לאחרונה, מספר פלטפורמות אוטומטיות למחצה, כולל Miltenyi CliniMACS Prodigy ("המעבד"), צצו כדי להתמודד עם מ.......

Acknowledgements

המחברים רוצים להכיר בתרומתם של מספר אנשים וארגונים לעבודה זו. המעבדה לתרפיה תאית וגנטית והמעבדה למחקרי תרגום וקורלציה של פן סיפקו סיוע רב ערך בפיתוח תהליכים ובהכנה להגשות IND. מליסה ורגזה ואמנדה דינופיה תרמו לתהליך, הפיתוח וההכנה להגשות IND העומדות בבסיס כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק האצה של התא ותרפיה גנטית שיתופית של בית החולים לילדים של פילדלפיה. המחברים רוצים גם להודות ל-Miltenyi Biotec על התמיכה הטכנית והמחקרית שלהם. איור 1 מכוסה על ידי זכויות יוצרים © 2023 Miltenyi Biotec B.V. &; Co. KG; כל הזכויות שמורות.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12 x 75 borosilicate tubesCharles RiverTL1000
20 mL Reagent BagMiltenyi Biotec170-076-631
50 mL Conical TubeFisher05-539-10
150 mL Transfer SetFenwal4R2001
2,000 mL Transfer SetFenwal4R2041
7AADFisher ScientificBDB559925
Alcohol PrepTyco/Healthcare
Bag AccessMedline2300E-0500
CD19 APC-Vio770 REAfinityMiltenyi Biotec130-113-643
CD19 CAR Detection Reagent BiotinMiltenyi Biotec130-129-550
CD19 PEBD555413
CD3 APCBD340440
CD4 VioBright FITC REAfinityMiltenyi Biotec130-113-229
CD45 VioBlue REAfinityMiltenyi Biotec130-110-637
CD8 APC-Vio770 REAfinityMiltenyi Biotec130-110-681
Cellometer Reference Beads 10umNexcelomB10-02-020
Cellometer Reference Beads 15umNexcelomB15-02-010
Cellometer Reference Beads 5umNexcelomB05-02-050
Cellometer SlidesNexcelomCHT4-SD100-002
CliniMACS CD4 GMP MicroBeadsMiltenyi Biotec276-01The CD4 reagent
CliniMACS CD8 GMP MicroBeadsMiltenyi Biotec275-01The CD8 reagent
CliniMACS PBS/EDTA BufferMiltenyi Biotec130-021-201The buffer
DMSOOrigenCP-10
Freezing Bag 50 mLMiltenyi Biotec200-074-400
Freezing Vial, 1.8 mLNunc12565171N
Freezing Vial, 4.5 mLNunc12565161N
Human AB serumValley BiomedicalSterile filtered, heat inactivated
Human Serum Albumin 25%Grifols68516-5216-1
Human Serum Albumin 5%Grifols68516-5214-1
MACS GMP Recombinant Human IL-2Miltenyi Biotec170-076-148The cytokines
MACS GMP T Cell TransActMiltenyi Biotec200-076-202The activation reagent
MycoSeq Mycoplasma Detection KitLife Technologies4460623
Needles, Hypodermic 14GMedlineSWD200573
Needles, SlideSafe 18GBDB-D305918
Pipet tips, 2-200 μL, individually wrappedEppendorf022492209
Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrappedEppendorf022492225
Pipets 10 mLFisher13-678-27F
Pipets 25 mLFisher13-675-30
Pipets 5 mLFisher13-678-27E
Plasmalyte-ABaxter2B2544XThe electrolyte solution
Prodigy TS520 Tubing SetMiltenyi Biotec170-076- 600The tubing set
Sterile FieldMedlineNON21001
Streptavidin PE-Vio770Miltenyi Biotec130-106-793
Syringe 1 mLBD309628
Syringe 10 mLBD302995
Syringe 3 mLBD309657
Syringe 30 mLBD302832
Syringe 50 mLBD309653
TexMACS GMP MediumMiltenyi Biotec170-076-306The medium
Triple Sampling AdapterMiltenyi Biotec170-076-609
Viral VectorCHOP Clinical Vector CorehuCART19
Equipment
Biological Safety CabinetThe Baker Co
Cellometer Auto 2000Nexcelom
CliniMACS ProdigyMiltenyi Biotec200-075-301The processor
Controlled Rate FreezerPlaner/Kryosave
Endosafe nexgen-PTS150KCharles River
Mettler BalanceMettler
Refrigerated CentrifugeThermo Fisher
Refrigerated CentrifugeFisher Sci
SCD Sterile Tubing WelderTerumo
Sebra Tube SealerSebra
VarithermBarkeyThe dry thaw device
XN-330 Hematology AnalyzerSysmex

References

  1. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  2. Shah, N. N., et al.

Explore More Articles

TCAR TCliniMACSTT CD4 CD8cGMPIND

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved