Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico em um processador de células automatizado

Summary

Este artigo detalha o processo de fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico para uso clínico, especificamente usando um processador de células automatizado capaz de realizar transdução viral e cultivo de células T. Fornecemos recomendações e descrevemos armadilhas que devem ser consideradas durante o processo de desenvolvimento e implementação de um ensaio clínico de fase inicial.

Abstract

As células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) representam uma abordagem imunoterapêutica promissora para o tratamento de várias doenças malignas e não malignas. As células CAR-T são células T geneticamente modificadas que expressam uma proteína quimérica que reconhece e se liga a um alvo de superfície celular, resultando na morte da célula-alvo. Os métodos tradicionais de fabricação de células CAR-T são trabalhosos, caros e podem trazer o risco de contaminação. O CliniMACS Prodigy, um processador de células automatizado, permite a fabricação de produtos de terapia celular em escala clínica em um sistema fechado, minimizando o risco de contaminação. O processamento ocorre de forma semiautomática sob o controle de um computador e, assim, minimiza o envolvimento humano no processo, o que economiza tempo e reduz a variabilidade e os erros.

Este manuscrito e vídeo descrevem o processo de transdução de células T (TCT) para a fabricação de células CAR-T usando este processador. O processo de TCT envolve enriquecimento, ativação, transdução de células T CD4+/CD8+ com vetor viral, expansão e colheita. Usando a Matriz de Atividades, uma funcionalidade que permite ordenar e cronometrar essas etapas, o processo de TCT pode ser personalizado extensivamente. Fornecemos um passo a passo da fabricação de células CAR-T em conformidade com as Boas Práticas de Fabricação atuais (cGMP) e discutimos os testes de liberação necessários e os experimentos pré-clínicos que darão suporte a uma aplicação de Novo Medicamento Investigacional (IND). Demonstramos a viabilidade e discutimos as vantagens e desvantagens do uso de um processo semiautomático para a fabricação clínica de células CAR-T. Finalmente, descrevemos um ensaio clínico em andamento iniciado por pesquisadores que tem como alvo malignidades pediátricas de células B [NCT05480449] como um exemplo de como esse processo de fabricação pode ser aplicado em um ambiente clínico.

Introduction

A transferência adotiva de células T projetadas para expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR) tem demonstrado notável eficácia no tratamento de pacientes com neoplasias malignas refratárias de células B ^1,2,3,4,5. No entanto, os métodos tradicionais de fabricação de células CAR-T são trabalhosos, demorados e exigem técnicos altamente treinados para realizar etapas altamente especializadas. Por exemplo, o processo tradicional de fabricação de um produto autólogo de células CAR-T envolve centrifugaçã....

Protocol

Todas as pesquisas foram realizadas de acordo com as diretrizes institucionais com aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do hospital, e todos os sujeitos forneceram consentimento informado para publicação dos dados coletados no contexto do estudo.
NOTA: A primeira seção do Protocolo fornece uma visão geral de alto nível do processo de fabricação do CAR-T. As seções restantes fornecem as instruções passo a passo. O protocolo descreve o fluxo de trabalho usando o software TCT versão 1.4, que.......

Discussion

A terapia com células CAR-T tem emergido como uma abordagem de tratamento promissora para células B e outras neoplasias. No entanto, os métodos tradicionais de fabricação de células CAR-T têm várias limitações, como alto custo, produção intensiva em mão-de-obra e etapas abertas que aumentam o risco de contaminação. Recentemente, várias plataformas semi-automatizadas, incluindo o Miltenyi CliniMACS Prodigy (o "processador"), surgiram para resolver essas limitações. O processo de transdução de células .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 x 75 borosilicate tubes	Charles River	TL1000
20 mL Reagent Bag	Miltenyi Biotec	170-076-631
50 mL Conical Tube	Fisher	05-539-10
150 mL Transfer Set	Fenwal	4R2001
2,000 mL Transfer Set	Fenwal	4R2041
7AAD	Fisher Scientific	BDB559925
Alcohol Prep	Tyco/Healthcare
Bag Access	Medline	2300E-0500
CD19 APC-Vio770 REAfinity	Miltenyi Biotec	130-113-643
CD19 CAR Detection Reagent Biotin	Miltenyi Biotec	130-129-550
CD19 PE	BD	555413
CD3 APC	BD	340440
CD4 VioBright FITC REAfinity	Miltenyi Biotec	130-113-229
CD45 VioBlue REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-637
CD8 APC-Vio770 REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-681
Cellometer Reference Beads 10um	Nexcelom	B10-02-020
Cellometer Reference Beads 15um	Nexcelom	B15-02-010
Cellometer Reference Beads 5um	Nexcelom	B05-02-050
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
CliniMACS CD4 GMP MicroBeads	Miltenyi Biotec	276-01	The CD4 reagent
CliniMACS CD8 GMP MicroBeads	Miltenyi Biotec	275-01	The CD8 reagent
CliniMACS PBS/EDTA Buffer	Miltenyi Biotec	130-021-201	The buffer
DMSO	Origen	CP-10
Freezing Bag 50 mL	Miltenyi Biotec	200-074-400
Freezing Vial, 1.8 mL	Nunc	12565171N
Freezing Vial, 4.5 mL	Nunc	12565161N
Human AB serum	Valley Biomedical		Sterile filtered, heat inactivated
Human Serum Albumin 25%	Grifols	68516-5216-1
Human Serum Albumin 5%	Grifols	68516-5214-1
MACS GMP Recombinant Human IL-2	Miltenyi Biotec	170-076-148	The cytokines
MACS GMP T Cell TransAct	Miltenyi Biotec	200-076-202	The activation reagent
MycoSeq Mycoplasma Detection Kit	Life Technologies	4460623
Needles, Hypodermic 14G	Medline	SWD200573
Needles, SlideSafe 18G	BD	B-D305918
Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped	Eppendorf	022492209
Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped	Eppendorf	022492225
Pipets 10 mL	Fisher	13-678-27F
Pipets 25 mL	Fisher	13-675-30
Pipets 5 mL	Fisher	13-678-27E
Plasmalyte-A	Baxter	2B2544X	The electrolyte solution
Prodigy TS520 Tubing Set	Miltenyi Biotec	170-076- 600	The tubing set
Sterile Field	Medline	NON21001
Streptavidin PE-Vio770	Miltenyi Biotec	130-106-793
Syringe 1 mL	BD	309628
Syringe 10 mL	BD	302995
Syringe 3 mL	BD	309657
Syringe 30 mL	BD	302832
Syringe 50 mL	BD	309653
TexMACS GMP Medium	Miltenyi Biotec	170-076-306	The medium
Triple Sampling Adapter	Miltenyi Biotec	170-076-609
Viral Vector	CHOP Clinical Vector Core		huCART19
Equipment
Biological Safety Cabinet	The Baker Co
Cellometer Auto 2000	Nexcelom
CliniMACS Prodigy	Miltenyi Biotec	200-075-301	The processor
Controlled Rate Freezer	Planer/Kryosave
Endosafe nexgen-PTS150K	Charles River
Mettler Balance	Mettler
Refrigerated Centrifuge	Thermo Fisher
Refrigerated Centrifuge	Fisher Sci
SCD Sterile Tubing Welder	Terumo
Sebra Tube Sealer	Sebra
Varitherm	Barkey		The dry thaw device
XN-330 Hematology Analyzer	Sysmex