Производство Т-клеток химерного антигенного рецептора на автоматизированном клеточном процессоре

Summary

В этой статье подробно описан процесс производства Т-клеток с химерным антигенным рецептором для клинического использования, в частности, с использованием автоматизированного клеточного процессора, способного выполнять вирусную трансдукцию и культивирование Т-клеток. Мы даем рекомендации и описываем подводные камни, которые следует учитывать при разработке процесса и проведении ранней фазы клинического исследования.

Abstract

Химерные антигенные рецепторы (CAR)-Т-клетки представляют собой перспективный иммунотерапевтический подход для лечения различных злокачественных и доброкачественных заболеваний. CAR-T-клетки — это генетически модифицированные Т-клетки, которые экспрессируют химерный белок, который распознает и связывается с мишенью на поверхности клетки, что приводит к уничтожению клетки-мишени. Традиционные методы производства CAR-T-клеток являются трудоемкими, дорогостоящими и могут быть сопряжены с риском загрязнения. CliniMACS Prodigy, автоматизированный клеточный процессор, позволяет производить продукты клеточной терапии в клиническом масштабе в закрытой системе, сводя к минимуму риск загрязнения. Обработка происходит в полуавтоматическом режиме под контролем компьютера и таким образом минимизирует участие человека в процессе, что экономит время и снижает вариативность и ошибки.

В этой рукописи и видео описывается процесс трансдукции Т-клеток (TCT) для производства CAR-T-клеток с использованием этого процессора. Процесс ТСТ включает обогащение, активацию, трансдукцию вирусным вектором CD4+/CD8+ Т-клеток, экспансию и сбор CD4+/CD8+ Т-клеток. С помощью Activity Matrix, функциональности, которая позволяет упорядочивать и определять время выполнения этих шагов, процесс TCT может быть полностью настроен. Мы проводим экскурсию по производству CAR-T-клеток в соответствии с действующей надлежащей производственной практикой (cGMP) и обсуждаем необходимые испытания и доклинические эксперименты, которые будут поддерживать заявку на экспериментальное новое лекарственное средство (IND). Мы демонстрируем осуществимость и обсуждаем преимущества и недостатки использования полуавтоматического процесса для клинического производства CAR-T-клеток. Наконец, мы описываем продолжающееся клиническое исследование, инициированное исследователем, которое нацелено на злокачественные новообразования у детей [NCT05480449] в качестве примера того, как этот производственный процесс может быть применен в клинических условиях.

Introduction

Адоптивный перенос Т-клеток, сконструированных для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), показал замечательную эффективность в лечении пациентов с рефрактерными В-клеточными злокачественными новообразованиями 1,2,3,4,5. Однако традиционные методы производства CAR-T-клеток являются трудоемкими, отнимают много времени и требуют высококвалифицированных технических специалистов для выполнения узкоспециализированных этапов. Например, традиционный процесс производства аутологичного CAR-T-клеточного пр....

Protocol

Все исследования были проведены в соответствии с институциональными рекомендациями с одобрения Институционального наблюдательного совета больницы (IRB), и все субъекты предоставили информированное согласие на публикацию данных, собранных в контексте исследования.
ПРИМЕЧАНИЕ: В пер?.......

Discussion

CAR-T-клеточная терапия стала перспективным подходом к лечению В-клеточных и других злокачественных новообразований. Однако традиционные методы производства CAR-T-клеток имеют ряд ограничений, таких как высокая стоимость, трудоемкое производство и открытые этапы, которые увеличивают рис.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 x 75 borosilicate tubes	Charles River	TL1000
20 mL Reagent Bag	Miltenyi Biotec	170-076-631
50 mL Conical Tube	Fisher	05-539-10
150 mL Transfer Set	Fenwal	4R2001
2,000 mL Transfer Set	Fenwal	4R2041
7AAD	Fisher Scientific	BDB559925
Alcohol Prep	Tyco/Healthcare
Bag Access	Medline	2300E-0500
CD19 APC-Vio770 REAfinity	Miltenyi Biotec	130-113-643
CD19 CAR Detection Reagent Biotin	Miltenyi Biotec	130-129-550
CD19 PE	BD	555413
CD3 APC	BD	340440
CD4 VioBright FITC REAfinity	Miltenyi Biotec	130-113-229
CD45 VioBlue REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-637
CD8 APC-Vio770 REAfinity	Miltenyi Biotec	130-110-681
Cellometer Reference Beads 10um	Nexcelom	B10-02-020
Cellometer Reference Beads 15um	Nexcelom	B15-02-010
Cellometer Reference Beads 5um	Nexcelom	B05-02-050
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
CliniMACS CD4 GMP MicroBeads	Miltenyi Biotec	276-01	The CD4 reagent
CliniMACS CD8 GMP MicroBeads	Miltenyi Biotec	275-01	The CD8 reagent
CliniMACS PBS/EDTA Buffer	Miltenyi Biotec	130-021-201	The buffer
DMSO	Origen	CP-10
Freezing Bag 50 mL	Miltenyi Biotec	200-074-400
Freezing Vial, 1.8 mL	Nunc	12565171N
Freezing Vial, 4.5 mL	Nunc	12565161N
Human AB serum	Valley Biomedical		Sterile filtered, heat inactivated
Human Serum Albumin 25%	Grifols	68516-5216-1
Human Serum Albumin 5%	Grifols	68516-5214-1
MACS GMP Recombinant Human IL-2	Miltenyi Biotec	170-076-148	The cytokines
MACS GMP T Cell TransAct	Miltenyi Biotec	200-076-202	The activation reagent
MycoSeq Mycoplasma Detection Kit	Life Technologies	4460623
Needles, Hypodermic 14G	Medline	SWD200573
Needles, SlideSafe 18G	BD	B-D305918
Pipet tips, 2-200 μL, individually wrapped	Eppendorf	022492209
Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrapped	Eppendorf	022492225
Pipets 10 mL	Fisher	13-678-27F
Pipets 25 mL	Fisher	13-675-30
Pipets 5 mL	Fisher	13-678-27E
Plasmalyte-A	Baxter	2B2544X	The electrolyte solution
Prodigy TS520 Tubing Set	Miltenyi Biotec	170-076- 600	The tubing set
Sterile Field	Medline	NON21001
Streptavidin PE-Vio770	Miltenyi Biotec	130-106-793
Syringe 1 mL	BD	309628
Syringe 10 mL	BD	302995
Syringe 3 mL	BD	309657
Syringe 30 mL	BD	302832
Syringe 50 mL	BD	309653
TexMACS GMP Medium	Miltenyi Biotec	170-076-306	The medium
Triple Sampling Adapter	Miltenyi Biotec	170-076-609
Viral Vector	CHOP Clinical Vector Core		huCART19
Equipment
Biological Safety Cabinet	The Baker Co
Cellometer Auto 2000	Nexcelom
CliniMACS Prodigy	Miltenyi Biotec	200-075-301	The processor
Controlled Rate Freezer	Planer/Kryosave
Endosafe nexgen-PTS150K	Charles River
Mettler Balance	Mettler
Refrigerated Centrifuge	Thermo Fisher
Refrigerated Centrifuge	Fisher Sci
SCD Sterile Tubing Welder	Terumo
Sebra Tube Sealer	Sebra
Varitherm	Barkey		The dry thaw device
XN-330 Hematology Analyzer	Sysmex