Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В этой статье подробно описан процесс производства Т-клеток с химерным антигенным рецептором для клинического использования, в частности, с использованием автоматизированного клеточного процессора, способного выполнять вирусную трансдукцию и культивирование Т-клеток. Мы даем рекомендации и описываем подводные камни, которые следует учитывать при разработке процесса и проведении ранней фазы клинического исследования.

Abstract

Химерные антигенные рецепторы (CAR)-Т-клетки представляют собой перспективный иммунотерапевтический подход для лечения различных злокачественных и доброкачественных заболеваний. CAR-T-клетки — это генетически модифицированные Т-клетки, которые экспрессируют химерный белок, который распознает и связывается с мишенью на поверхности клетки, что приводит к уничтожению клетки-мишени. Традиционные методы производства CAR-T-клеток являются трудоемкими, дорогостоящими и могут быть сопряжены с риском загрязнения. CliniMACS Prodigy, автоматизированный клеточный процессор, позволяет производить продукты клеточной терапии в клиническом масштабе в закрытой системе, сводя к минимуму риск загрязнения. Обработка происходит в полуавтоматическом режиме под контролем компьютера и таким образом минимизирует участие человека в процессе, что экономит время и снижает вариативность и ошибки.

В этой рукописи и видео описывается процесс трансдукции Т-клеток (TCT) для производства CAR-T-клеток с использованием этого процессора. Процесс ТСТ включает обогащение, активацию, трансдукцию вирусным вектором CD4+/CD8+ Т-клеток, экспансию и сбор CD4+/CD8+ Т-клеток. С помощью Activity Matrix, функциональности, которая позволяет упорядочивать и определять время выполнения этих шагов, процесс TCT может быть полностью настроен. Мы проводим экскурсию по производству CAR-T-клеток в соответствии с действующей надлежащей производственной практикой (cGMP) и обсуждаем необходимые испытания и доклинические эксперименты, которые будут поддерживать заявку на экспериментальное новое лекарственное средство (IND). Мы демонстрируем осуществимость и обсуждаем преимущества и недостатки использования полуавтоматического процесса для клинического производства CAR-T-клеток. Наконец, мы описываем продолжающееся клиническое исследование, инициированное исследователем, которое нацелено на злокачественные новообразования у детей [NCT05480449] в качестве примера того, как этот производственный процесс может быть применен в клинических условиях.

Introduction

Адоптивный перенос Т-клеток, сконструированных для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), показал замечательную эффективность в лечении пациентов с рефрактерными В-клеточными злокачественными новообразованиями 1,2,3,4,5. Однако традиционные методы производства CAR-T-клеток являются трудоемкими, отнимают много времени и требуют высококвалифицированных технических специалистов для выполнения узкоспециализированных этапов. Например, традиционный процесс производства аутологичного CAR-T-клеточного пр....

Protocol

Все исследования были проведены в соответствии с институциональными рекомендациями с одобрения Институционального наблюдательного совета больницы (IRB), и все субъекты предоставили информированное согласие на публикацию данных, собранных в контексте исследования.
ПРИМЕЧАНИЕ: В пер?.......

Representative Results

Результаты первых трех серий производства CAR-T в рамках исследования NCT05480449 представлены ниже в таблице 3. Исходный материал, вектор, культуральные цитокины и концентрации АТ в сыворотке крови поддерживались постоянными для каждого запуска. Продукты собирали на 7 или 8 день. Сре?.......

Discussion

CAR-T-клеточная терапия стала перспективным подходом к лечению В-клеточных и других злокачественных новообразований. Однако традиционные методы производства CAR-T-клеток имеют ряд ограничений, таких как высокая стоимость, трудоемкое производство и открытые этапы, которые увеличивают рис.......

Acknowledgements

Авторы выражают признательность нескольким лицам и организациям за вклад в эту работу. Лаборатория клеточной и генной терапии и Лаборатория трансляционных и коррелятивных исследований Пенсильванского университета оказали ценную помощь в разработке процессов и подготовке к подаче заявок на IND. Мелисса Варгезе (Melissa Varghese) и Аманда ДиНофиа (Amanda DiNofia) внесли свой вклад в разработку процесса и подготовку к подаче заявок на IND, которые легли в основу этой рукописи. Эта работа была поддержана грантом Acceleration Grant of the Cell and Gene Therapy Collaborative of the Children's Hospital of Philadelphia. Авторы также хотели бы поблагодарить компанию Miltenyi B....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
12 x 75 borosilicate tubesCharles RiverTL1000
20 mL Reagent BagMiltenyi Biotec170-076-631
50 mL Conical TubeFisher05-539-10
150 mL Transfer SetFenwal4R2001
2,000 mL Transfer SetFenwal4R2041
7AADFisher ScientificBDB559925
Alcohol PrepTyco/Healthcare
Bag AccessMedline2300E-0500
CD19 APC-Vio770 REAfinityMiltenyi Biotec130-113-643
CD19 CAR Detection Reagent BiotinMiltenyi Biotec130-129-550
CD19 PEBD555413
CD3 APCBD340440
CD4 VioBright FITC REAfinityMiltenyi Biotec130-113-229
CD45 VioBlue REAfinityMiltenyi Biotec130-110-637
CD8 APC-Vio770 REAfinityMiltenyi Biotec130-110-681
Cellometer Reference Beads 10umNexcelomB10-02-020
Cellometer Reference Beads 15umNexcelomB15-02-010
Cellometer Reference Beads 5umNexcelomB05-02-050
Cellometer SlidesNexcelomCHT4-SD100-002
CliniMACS CD4 GMP MicroBeadsMiltenyi Biotec276-01The CD4 reagent
CliniMACS CD8 GMP MicroBeadsMiltenyi Biotec275-01The CD8 reagent
CliniMACS PBS/EDTA BufferMiltenyi Biotec130-021-201The buffer
DMSOOrigenCP-10
Freezing Bag 50 mLMiltenyi Biotec200-074-400
Freezing Vial, 1.8 mLNunc12565171N
Freezing Vial, 4.5 mLNunc12565161N
Human AB serumValley BiomedicalSterile filtered, heat inactivated
Human Serum Albumin 25%Grifols68516-5216-1
Human Serum Albumin 5%Grifols68516-5214-1
MACS GMP Recombinant Human IL-2Miltenyi Biotec170-076-148The cytokines
MACS GMP T Cell TransActMiltenyi Biotec200-076-202The activation reagent
MycoSeq Mycoplasma Detection KitLife Technologies4460623
Needles, Hypodermic 14GMedlineSWD200573
Needles, SlideSafe 18GBDB-D305918
Pipet tips, 2-200 μL, individually wrappedEppendorf022492209
Pipet tips, 50-1000 μL, individually wrappedEppendorf022492225
Pipets 10 mLFisher13-678-27F
Pipets 25 mLFisher13-675-30
Pipets 5 mLFisher13-678-27E
Plasmalyte-ABaxter2B2544XThe electrolyte solution
Prodigy TS520 Tubing SetMiltenyi Biotec170-076- 600The tubing set
Sterile FieldMedlineNON21001
Streptavidin PE-Vio770Miltenyi Biotec130-106-793
Syringe 1 mLBD309628
Syringe 10 mLBD302995
Syringe 3 mLBD309657
Syringe 30 mLBD302832
Syringe 50 mLBD309653
TexMACS GMP MediumMiltenyi Biotec170-076-306The medium
Triple Sampling AdapterMiltenyi Biotec170-076-609
Viral VectorCHOP Clinical Vector CorehuCART19
Equipment
Biological Safety CabinetThe Baker Co
Cellometer Auto 2000Nexcelom
CliniMACS ProdigyMiltenyi Biotec200-075-301The processor
Controlled Rate FreezerPlaner/Kryosave
Endosafe nexgen-PTS150KCharles River
Mettler BalanceMettler
Refrigerated CentrifugeThermo Fisher
Refrigerated CentrifugeFisher Sci
SCD Sterile Tubing WelderTerumo
Sebra Tube SealerSebra
VarithermBarkeyThe dry thaw device
XN-330 Hematology AnalyzerSysmex

References

  1. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  2. Shah, N. N., et al.

Explore More Articles

CAR TCliniMACS ProdigyCD4 CD8cGMPIND

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved