JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biology

طرق تضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا في الهلاميات المائية على نطاق واسع

Published: June 23rd, 2023

DOI:

10.3791/65500

1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London
* These authors contributed equally

هنا ، نقدم بروتوكولين لتضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا في مصفوفات هيدروجيل على نطاق واسع دون الحاجة إلى مرحلة سائلة خارجية.

توفر شبكات الجينات الاصطناعية منصة للعلماء والمهندسين لتصميم وبناء أنظمة جديدة ذات وظائف مشفرة على المستوى الجيني. في حين أن النموذج السائد لنشر شبكات الجينات هو داخل الهيكل الخلوي ، يمكن أيضا نشر شبكات الجينات الاصطناعية في بيئات خالية من الخلايا. تشمل التطبيقات الواعدة لشبكات الجينات الخالية من الخلايا أجهزة الاستشعار الحيوية ، حيث تم إثبات هذه الأجهزة ضد الأهداف الحيوية (فيروسات الإيبولا وزيكا و SARS-CoV-2) واللاأحيائية (المعادن الثقيلة والكبريتيدات والمبيدات الحشرية والملوثات العضوية الأخرى). عادة ما يتم نشر الأنظمة الخالية من الخلايا في شكل سائل داخل وعاء التفاعل. ومع ذلك ، فإن القدرة على تضمين مثل هذه التفاعلات في مصفوفة مادية قد تسهل تطبيقها على نطاق أوسع في مجموعة أوسع من البيئات. تحقيقا لهذه الغاية ، تم تطوير طرق لتضمين تفاعلات تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) في مجموعة متنوعة من مصفوفات الهيدروجيل. واحدة من الخصائص الرئيسية للهلاميات المائية التي تفضي إلى هذا العمل هي قدرة إعادة تكوين المياه العالية لمواد الهيدروجيل. بالإضافة إلى ذلك ، تمتلك الهلاميات المائية خصائص فيزيائية وكيميائية مفيدة وظيفيا. يمكن تجفيف الهلاميات المائية بالتجميد للتخزين وإعادة ترطيبها لاستخدامها لاحقا. يتم تقديم بروتوكولين خطوة بخطوة لإدراج وفحص تفاعلات CFPS في الهلاميات المائية. أولا ، يمكن دمج نظام CFPS في هيدروجيل عن طريق الإماهة باستخدام محلول الخلية. يمكن بعد ذلك تحفيز النظام داخل الهيدروجيل أو التعبير عنه بشكل أساسي للتعبير الكامل عن البروتين من خلال الهيدروجيل. ثانيا ، يمكن إدخال محللة الخلية إلى هيدروجيل عند نقطة البلمرة ، ويمكن تجفيف النظام بأكمله بالتجميد وإعادة ترطيبه في وقت لاحق باستخدام محلول مائي يحتوي على محفز لنظام التعبير المشفر داخل الهيدروجيل. هذه الطرق لديها القدرة على السماح بشبكات الجينات الخالية من الخلايا التي تمنح القدرات الحسية لمواد الهيدروجيل ، مع إمكانية نشرها خارج المختبر.

تدمج البيولوجيا التركيبية تخصصات هندسية متنوعة لتصميم وهندسة الأجزاء والأجهزة والأنظمة القائمة على أساس بيولوجي والتي يمكنها أداء وظائف غير موجودة في الطبيعة. لا تزال معظم مناهج البيولوجيا التركيبية مرتبطة بالخلايا الحية. على النقيض من ذلك ، تسهل أنظمة البيولوجيا التركيبية الخالية من الخلايا مستويات غير مسبوقة من التحكم والحرية في التصميم ، مما يتيح زيادة المرونة وتقصير الوقت لهندسة الأنظمة البيولوجية مع القضاء على العديد من قيود طرق التعبير الجيني التقليدية القائمة على الخلايا1،2،3. يتم استخدام CFPS في عدد متزايد من التطبيقات عبر العديد من التخصصات ، بما في ذلك بناء الخلايا ....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. خلية محللة العازلة وإعداد الوسائط

  1. تحضير 2x YT + P أجار ومتوسطة
    1. تحضير 2x YT + P أجار عن طريق قياس 16 جم / لتر من التربتون ، و 10 جم / لتر من خلاصة الخميرة ، و 5 جم / لتر من كلوريد الصوديوم ، و 40 مل / لتر 1 MK 2 HPO 4 ، و 22 مل / لتر 1 M KH2PO4 ، و 15 جم / لتر أجار. بالنسبة لمرق 2x YT +.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يفصل هذا البروتوكول طريقتين لتضمين تفاعلات CFPS في مصفوفات الهيدروجيل ، مع الشكل 1 يقدم نظرة عامة تخطيطية على النهجين. كلتا الطريقتين قابلة للتجفيف بالتجميد والتخزين طويل الأجل. الطريقة أ هي المنهجية الأكثر استخداما لسببين. أولا ، لقد ثبت أنها الطريقة الأكثر قابلية للتطبيق .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

فيما يلي بروتوكولان لدمج تفاعلات CFPS القائمة على تحلل خلايا الإشريكية القولونية في الهلاميات المائية للأغاروز. تسمح هذه الطرق بالتعبير الجيني المتزامن في جميع أنحاء المادة. يمكن تكييف البروتوكول مع أنظمة CFPS الأخرى وقد تم إجراؤه بنجاح باستخدام مجموعات CFPS المتاحة تجاريا بالإضافة إلى ?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يقر المؤلفون تقديرا كبيرا بدعم جوائز مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية BB / V017551 / 1 (S.K. ، T.P.H.) و BB / W01095X / 1 (A.L. ، T.P.H.) ، ومجلس أبحاث العلوم الهندسية والفيزيائية - جائزة مختبرات علوم وتكنولوجيا الدفاع EP / N026683 / 1 (C.J.W. ، A.M.B. ، T.P.H.). البيانات التي تدعم هذا المنشور متاحة علنا على: 10.25405/data.ncl.22232452. لغرض الوصول المفتوح ، قام المؤلف بتطبيق ترخيص المشاع الإبداعي (CC BY) على أي نسخة مخطوطة مقبولة من المؤلف ناشئة.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
3-PGASanta Cruz Biotechnologysc-214793B
Acetic AcidSigma-AldrichA6283
AgarThermo Fisher ScientificA10752.22
AgaroseSevern Biotech30-15-50
Amino Acid Sampler KitVWRBTRABR1401801
ATPSigma-AldrichA8937-1G
cAMPSigma-AldrichA9501-1G
Coenzyme A (CoA)Sigma-AldrichC4282-100MG
CTPAlfa AesarJ14121.MC
DTTThermo Fisher ScientificR0862
Folinic AcidSigma-AldrichF7878-100MG
GTPCarbosynthNG01208
HEPESSigma-AldrichH4034-25G
K-glutamateSigma-AldrichG1149-100G
LysozymeSigma-AldrichL6876-1G
Mg-glutamateSigma-Aldrich49605-250G
NADSigma-AldrichN6522-250MG
PEG-8000PromegaV3011
Potassium Hydroxide (KOH)Sigma-Aldrich757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichRDD037-500G
Protease Inhibitor cocktailSigma-AldrichP2714-1BTL
Qubit Protein concentration kitThermo Fisher ScientificA50668
Rossetta 2 DE 3 E.coliSigma-Aldrich71397-3
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888-500G
SpermidineSigma-Aldrich85558-1G
TryptoneThermo Fisher Scientific211705
TrisSigma-AldrichGE17-1321-01
tRNASigma-Aldrich10109541001
UTPAlfa AesarJ23160.MC
Yeast ExtractSigma-AldrichY1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubesSigma-AldrichHS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettesThermo Fisher Scientific66381
15 mL centrifuge tubeSarstedt62.554.502
50 mL centrifuge bottlesSarstedt62.547.254
500 mL centrifuge bottlesThermo Fisher Scientific3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryerChristpart no. 101521, 101522, 101527
Benchtop CentrifugeThermo Fisher ScientificH-X3R
Black 384 well microtitre platesFischer Scientific66
CuvettesThermo Fisher Scientific222S
Elga Purelab ChorusElga#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425REppendorfEP00532
High Speed CentrifugeBeckman CoulterB34183
JMP licenseSAS Institute15
Magnetic StirrerFischer Scientific15353518
ParafilmAmcorPM-966
Photospectrometer (Biophotometer)Eppendorf16713
Pipettes and tipsGilson#####
Precision BalanceSartorius16384738
Qubit 2.0 FluorometerThermo Fisher ScientificQ32866
Shaking IncubatorThermo Fisher ScientificSHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)Thermo Fisher Scientific12893543
Static IncubatorSanyoMIR-162
Syringe and needlesThermo Fisher Scientific66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)Thermo Fisher ScientificSHKE8000
Varioskan Lux platereaderThermo Fisher ScientificVLBL00GD1
Vortex Genie 2Cole-parmerOU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meterVWR662-1657

  1. Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
  2. Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).
  3. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  4. Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
  5. Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
  6. Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).
  7. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  8. Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).
  9. Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702 (2020).
  10. Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).
  11. Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
  12. Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).
  13. Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261 (2019).
  14. Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
  15. Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).
  16. Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).
  17. Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
  18. Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050 (2020).
  19. Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).
  20. Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).
  21. Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
  22. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  23. Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).
  24. Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
  25. Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).
  26. Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150 (2020).
  27. Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
  28. Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
  29. Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165 (2013).
  30. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  31. Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
  32. Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).
  33. Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , (2020).
  34. Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
  35. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  36. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  37. Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved