Metoder til indlejring af cellefrie proteinsyntesereaktioner i hydrogeler i makroskala

Her præsenterer vi to protokoller til indlejring af cellefrie proteinsyntesereaktioner i hydrogelmatricer i makroskala uden behov for en ekstern væskefase.

Syntetiske gennetværk giver en platform for forskere og ingeniører til at designe og bygge nye systemer med funktionalitet kodet på et genetisk niveau. Mens det dominerende paradigme for udbredelsen af gennetværk er inden for et cellulært chassis, kan syntetiske gennetværk også anvendes i cellefrie miljøer. Lovende anvendelser af cellefrie gennetværk inkluderer biosensorer, da disse enheder er blevet demonstreret mod biotiske (Ebola-, Zika- og SARS-CoV-2-vira) og abiotiske (tungmetaller, sulfider, pesticider og andre organiske forurenende stoffer) mål. Cellefrie systemer implementeres typisk i flydende form i en reaktionsbeholder. At være i stand til at integrere sådanne reaktioner i en fysisk matrix kan imidlertid lette deres bredere anvendelse i et bredere sæt miljøer. Til dette formål er der udviklet metoder til indlejring af cellefri proteinsyntese (CFPS) reaktioner i en række hydrogelmatricer. En af de vigtigste egenskaber ved hydrogeler, der bidrager til dette arbejde, er hydrogelmaterialernes højvandsrekonstitutionskapacitet. Derudover har hydrogeler fysiske og kemiske egenskaber, der er funktionelt gavnlige. Hydrogeler kan frysetørres til opbevaring og rehydreres til senere brug. To trinvise protokoller til inkludering og analyse af CFPS-reaktioner i hydrogeler præsenteres. For det første kan et CFPS-system inkorporeres i en hydrogel via rehydrering med et cellelysat. Systemet i hydrogelen kan derefter induceres eller udtrykkes konstitutivt for fuldstændig proteinekspression gennem hydrogelen. For det andet kan cellelysat indføres i en hydrogel ved polymerisationspunktet, og hele systemet kan frysetørres og rehydreres på et senere tidspunkt med en vandig opløsning indeholdende induceren til ekspressionssystemet kodet i hydrogelen. Disse metoder har potentialet til at muliggøre cellefrie gennetværk, der giver sensoriske evner til hydrogelmaterialer, med potentiale for udbredelse uden for laboratoriet.

Syntetisk biologi integrerer forskellige tekniske discipliner til at designe og konstruere biologisk baserede dele, enheder og systemer, der kan udføre funktioner, der ikke findes i naturen. De fleste syntetiske biologiske tilgange er stadig bundet til levende celler. I modsætning hertil muliggør cellefrie syntetiske biologiske systemer hidtil usete niveauer af kontrol og frihed i design, hvilket muliggør øget fleksibilitet og en forkortet tid til konstruktion af biologiske systemer, samtidig med at mange af begrænsningerne ved traditionelle cellebaserede genekspressionsmetoder elimineres1,2,3.

1. Cellelysatbuffer og medieforberedelse

1. Fremstilling af 2x YT+P agar og medium
   1. Forbered 2x YT+P agar ved at afmåle 16 g/L trypton, 10 g/L gærekstrakt, 5 g/L NaCl, 40 ml/L 1 M K 2 HPO 4, 22 ml/L 1 M KH₂PO₄ og 15 g/L agar. For 2x YT + P bouillon skal du følge den foregående sammensætning, men udelade agaren.
   2. Steriliser ved at autoklavere 2x YT+P.
2. Forberedelse af S30A-bufferen
   1. S30A-bufferen fremstilles.......

Denne protokol beskriver to metoder til indlejring af CFPS-reaktioner i hydrogelmatricer, hvor figur 1 viser en skematisk oversigt over de to tilgange. Begge metoder kan frysetørres og langtidsopbevares. Metode A er den mest anvendte metode af to grunde. For det første har det vist sig at være den mest anvendelige metode til at arbejde med en række hydrogelmaterialer¹¹. For det andet giver metode A mulighed for parallel testning af genetiske konstruktioner. Metod.......

Skitseret her er to protokoller til inkorporering af E. coli-cellelysatbaserede CFPS-reaktioner i agarosehydrogeler . Disse metoder muliggør samtidig genekspression i hele materialet. Protokollen kan tilpasses til andre CFPS-systemer og er med succes blevet gennemført med kommercielt tilgængelige CFPS-sæt ud over de laboratoriefremstillede cellelysater, der er beskrevet her. Det er vigtigt, at protokollen tillader genekspression i fravær af en ekstern væskefase. Det betyder, at systemet er selvstændigt og.......

Forfatterne anerkender i høj grad støtten fra Biotechnology and Biological Sciences Research Council awards BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) og BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) og Engineering and Physical Sciences Research Council - Defence Science and Technology Laboratories award EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Data til støtte for denne publikation er frit tilgængelige på: 10.25405/data.ncl.22232452. Med henblik på fri adgang har forfatteren anvendt en Creative Commons Attribution (CC BY) licens til enhver Author Accepted Manuscript version, der opstår.