Methoden voor het inbedden van celvrije eiwitsynthesereacties in hydrogels op macroschaal

Hier presenteren we twee protocollen voor het inbedden van celvrije eiwitsynthesereacties in hydrogelmatrices op macroschaal zonder dat er een externe vloeibare fase nodig is.

Synthetische gennetwerken bieden een platform voor wetenschappers en ingenieurs om nieuwe systemen te ontwerpen en te bouwen met functionaliteit gecodeerd op genetisch niveau. Hoewel het dominante paradigma voor de inzet van gennetwerken zich binnen een cellulair chassis bevindt, kunnen synthetische gennetwerken ook worden ingezet in celvrije omgevingen. Veelbelovende toepassingen van celvrije gennetwerken omvatten biosensoren, omdat deze apparaten zijn aangetoond tegen biotische (Ebola, Zika en SARS-CoV-2-virussen) en abiotische (zware metalen, sulfiden, pesticiden en andere organische verontreinigingen) doelen. Celvrije systemen worden meestal in vloeibare vorm ingezet in een reactievat. Het kunnen inbedden van dergelijke reacties in een fysieke matrix kan echter hun bredere toepassing in een bredere reeks omgevingen vergemakkelijken. Hiertoe zijn methoden ontwikkeld voor het inbedden van celvrije eiwitsynthese (CFPS) reacties in een verscheidenheid aan hydrogelmatrices. Een van de belangrijkste eigenschappen van hydrogels die bevorderlijk zijn voor dit werk is de hoogwaterreconstitutiecapaciteit van hydrogelmaterialen. Bovendien bezitten hydrogels fysische en chemische eigenschappen die functioneel gunstig zijn. Hydrogels kunnen worden gevriesdroogd voor opslag en gerehydrateerd voor later gebruik. Twee stapsgewijze protocollen voor de inclusie en bepaling van CFPS-reacties in hydrogels worden gepresenteerd. Ten eerste kan een CFPS-systeem via rehydratie met een cellysaat in een hydrogel worden opgenomen. Het systeem in de hydrogel kan vervolgens worden geïnduceerd of constitutief worden uitgedrukt voor volledige eiwitexpressie via de hydrogel. Ten tweede kan cellysaat worden geïntroduceerd in een hydrogel op het punt van polymerisatie en kan het hele systeem worden gevriesdroogd en op een later punt worden gerehydrateerd met een waterige oplossing die de inductor bevat voor het expressiesysteem gecodeerd in de hydrogel. Deze methoden hebben het potentieel om celvrije gennetwerken mogelijk te maken die sensorische mogelijkheden verlenen aan hydrogelmaterialen, met het potentieel voor inzet buiten het laboratorium.

Synthetische biologie integreert verschillende technische disciplines om biologisch gebaseerde onderdelen, apparaten en systemen te ontwerpen en te engineeren die functies kunnen uitvoeren die niet in de natuur voorkomen. De meeste synthetische biologische benaderingen zijn nog steeds gebonden aan levende cellen. Celvrije synthetische biologiesystemen daarentegen vergemakkelijken ongekende niveaus van controle en vrijheid in ontwerp, waardoor meer flexibiliteit en een kortere tijd voor het ontwerpen van biologische systemen mogelijk zijn, terwijl veel van de beperkingen van traditionele op cellen gebaseerde genexpressiemethoden worden geëlimineerd ^1,....

1. Cellysaatbuffer en mediabereiding

1. Bereiding van 2x YT+P agar en medium
   1. Bereid 2x YT+P agar door 16 g/L trypton, 10 g/L gistextract, 5 g/L NaCl, 40 ml/l 1 M K 2 HPO 4, 22 ml/l 1M KH₂PO₄ en 15 g/L agar uit te meten. Volg voor de 2x YT+P bouillon de vorige samenstelling maar laat de agar weg.
   2. Steriliseer door de 2x YT+P te autoclaveren.
2. Voorbereiding van de S30A-buffer
   1. Bereid de S30A-buffer voor met 5,88 .......

Dit protocol beschrijft twee methoden voor het inbedden van CFPS-reacties in hydrogelmatrices, waarbij figuur 1 een schematisch overzicht van de twee benaderingen geeft. Beide methoden zijn geschikt voor vriesdrogen en langdurige opslag. Methode A is om twee redenen de meest gebruikte methodologie. Ten eerste is aangetoond dat het de meest geschikte methode is voor het werken met een reeks hydrogelmaterialen¹¹. Ten tweede maakt methode A het mogelijk om genetische co.......

Hier worden twee protocollen beschreven voor de opname van op E. coli-cellysaat gebaseerde CFPS-reacties in agarose-hydrogels . Deze methoden maken gelijktijdige genexpressie in het hele materiaal mogelijk. Het protocol kan worden aangepast voor andere CFPS-systemen en is met succes uitgevoerd met in de handel verkrijgbare CFPS-kits naast de in het laboratorium bereide cellysaten die hier worden beschreven. Belangrijk is dat het protocol genexpressie mogelijk maakt in afwezigheid van een externe vloeibare fase. .......

De auteurs erkennen de steun van de Biotechnology and Biological Sciences Research Council awards BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) en BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), en de Engineering and Physical Sciences Research Council - Defence Science and Technology Laboratories award EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Gegevens ter ondersteuning van deze publicatie zijn open beschikbaar op: 10.25405/data.ncl.22232452. Met het oog op open access heeft de auteur een Creative Commons Attribution (CC BY) licentie toegepast op elke Author Accepted Manuscript-versie die ontstaat.