Methoden zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in makroskalige Hydrogele

In dieser Arbeit stellen wir zwei Protokolle zur Einbettung zellfreier Proteinsynthesereaktionen in makroskalige Hydrogelmatrices vor, ohne dass eine externe Flüssigphase erforderlich ist.

Synthetische Gennetzwerke bieten Wissenschaftlern und Ingenieuren eine Plattform, um neuartige Systeme mit Funktionen zu entwerfen und zu bauen, die auf genetischer Ebene kodiert sind. Während das vorherrschende Paradigma für den Einsatz von Gennetzwerken innerhalb eines zellulären Chassis liegt, können synthetische Gennetzwerke auch in zellfreien Umgebungen eingesetzt werden. Zu den vielversprechenden Anwendungen zellfreier Gennetzwerke gehören Biosensoren, da diese Geräte gegen biotische (Ebola-, Zika- und SARS-CoV-2-Viren) und abiotische (Schwermetalle, Sulfide, Pestizide und andere organische Verunreinigungen) Ziele nachgewiesen wurden. Zellfreie Systeme werden in der Regel in flüssiger Form in einem Reaktionsgefäß eingesetzt. Die Möglichkeit, solche Reaktionen in eine physikalische Matrix einzubetten, kann jedoch ihre breitere Anwendung in einer breiteren Palette von Umgebungen erleichtern. Zu diesem Zweck wurden Methoden zur Einbettung von Reaktionen der zellfreien Proteinsynthese (CFPS) in eine Vielzahl von Hydrogelmatrices entwickelt. Eine der wichtigsten Eigenschaften von Hydrogelen, die für diese Arbeit förderlich sind, ist die hohe Wasserrekonstitutionskapazität von Hydrogelmaterialien. Darüber hinaus besitzen Hydrogele physikalische und chemische Eigenschaften, die funktionell vorteilhaft sind. Hydrogele können für die Lagerung gefriergetrocknet und für die spätere Verwendung rehydriert werden. Es werden zwei Schritt-für-Schritt-Protokolle für den Einschluss und die Analyse von CFPS-Reaktionen in Hydrogelen vorgestellt. Zunächst kann ein CFPS-System durch Rehydrierung mit einem Zelllysat in ein Hydrogel eingebaut werden. Das System innerhalb des Hydrogels kann dann für eine vollständige Proteinexpression durch das Hydrogel induziert oder konstitutiv exprimiert werden. Zweitens kann Zelllysat am Punkt der Polymerisation in ein Hydrogel eingebracht werden, und das gesamte System kann gefriergetrocknet und zu einem späteren Zeitpunkt mit einer wässrigen Lösung rehydriert werden, die den Induktor für das in dem Hydrogel kodierte Expressionssystem enthält. Diese Methoden haben das Potenzial, zellfreie Gennetzwerke zu ermöglichen, die Hydrogelmaterialien sensorische Fähigkeiten verleihen, mit dem Potenzial, über das Labor hinaus eingesetzt zu werden.

Die synthetische Biologie integriert verschiedene Ingenieurdisziplinen, um biologisch basierte Teile, Geräte und Systeme zu entwerfen und zu konstruieren, die Funktionen ausführen können, die in der Natur nicht vorkommen. Die meisten Ansätze der synthetischen Biologie sind immer noch an lebende Zellen gebunden. Im Gegensatz dazu ermöglichen zellfreie Systeme der synthetischen Biologie ein noch nie dagewesenes Maß an Kontrolle und Freiheit beim Design, was eine erhöhte Flexibilität und eine verkürzte Zeit für die Entwicklung biologischer Systeme ermöglicht und gleichzeitig viele der Einschränkungen herkömmlicher zellbasierter Genexpressionsmetho....

1. Zelllysatpuffer und Medienvorbereitung

1. Herstellung von 2x YT+P Agar und Medium
   1. Bereiten Sie 2x YT+P-Agar vor, indem Sie 16 g/L Trypton, 10 g/L Hefeextrakt, 5 g/L NaCl, 40 ml/L 1 M K 2 HPO 4, 22mL/L 1 M KH₂PO₄ und 15 g/L Agar abmessen. Für die 2x YT+P Brühe die vorherige Zusammensetzung befolgen, aber den Agar weglassen.
   2. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren der 2x YT+P.
2. Vorbereitung des S30A-Puffers
   1. .......

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden zur Einbettung von CFPS-Reaktionen in Hydrogel-Matrizen, wobei Abbildung 1 eine schematische Übersicht der beiden Ansätze zeigt. Beide Methoden eignen sich für die Gefriertrocknung und Langzeitlagerung. Methode A ist aus zwei Gründen die am häufigsten verwendete Methodik. Erstens hat sich gezeigt, dass es das am besten anwendbare Verfahren für die Arbeit mit einer Reihe von Hydrogelmaterialien¹¹ ist. Zweitens ermöglich.......

Im Folgenden werden zwei Protokolle für den Einbau von CFPS-Reaktionen auf Basis von E. coli-Zelllysaten in Agarose-Hydrogele beschrieben . Diese Methoden ermöglichen eine gleichzeitige Genexpression im gesamten Material. Das Protokoll kann für andere CFPS-Systeme angepasst werden und wurde zusätzlich zu den hier beschriebenen im Labor hergestellten Zelllysaten erfolgreich mit kommerziell erhältlichen CFPS-Kits durchgeführt. Wichtig ist, dass das Protokoll die Genexpression in Abwesenheit einer externen fl.......

Die Autoren bedanken sich sehr für die Unterstützung durch die Auszeichnungen des Biotechnology and Biological Sciences Research Council BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) und BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) sowie des Engineering and Physical Sciences Research Council - Defence Science and Technology Laboratories Award EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Die Daten zu dieser Veröffentlichung sind unter folgender Adresse verfügbar: 10.25405/data.ncl.22232452. Zum Zwecke des Open Access hat der Autor eine Creative Commons Attribution (CC BY)-Lizenz auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet.