JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biology

שיטות להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים בהידרוג'לים בקנה מידה מאקרו

Published: June 23rd, 2023

DOI:

10.3791/65500

1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London
* These authors contributed equally

במאמר זה אנו מציגים שני פרוטוקולים להטמעת תגובות סינתזת חלבונים נטולי תאים במטריצות הידרוג'ל בקנה מידה מאקרו ללא צורך בפאזה נוזלית חיצונית.

רשתות גנים סינתטיות מספקות פלטפורמה למדענים ומהנדסים לתכנן ולבנות מערכות חדשניות עם פונקציונליות המקודדת ברמה גנטית. בעוד הפרדיגמה השלטת לפריסת רשתות גנים היא בתוך שלדה תאית, רשתות גנים סינתטיות עשויות להיות פרוסות גם בסביבות נטולות תאים. יישומים מבטיחים של רשתות גנים נטולות תאים כוללים ביו-חיישנים, שכן התקנים אלה הוכחו נגד מטרות ביוטיות (נגיפי אבולה, זיקה ו-SARS-CoV-2) וא-ביוטיות (מתכות כבדות, סולפידים, חומרי הדברה ומזהמים אורגניים אחרים). מערכות נטולות תאים נפרסות בדרך כלל בצורה נוזלית בתוך כלי תגובה. היכולת להטמיע תגובות כאלה במטריצה פיזיקלית, לעומת זאת, עשויה להקל על היישום הרחב יותר שלהן בקבוצה רחבה יותר של סביבות. לשם כך פותחו שיטות להטמעת תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) במגוון מטריצות הידרוג'ל. אחד המאפיינים העיקריים של הידרוג'לים התורמים לעבודה זו הוא יכולת הבנייה מחדש של מים גבוהים של חומרי הידרוג'ל. בנוסף, הידרוג'לים הם בעלי מאפיינים פיזיקליים וכימיים המועילים מבחינה תפקודית. ניתן לייבש הידרוג'לים בהקפאה לאחסון ולהתייבש מחדש לשימוש מאוחר יותר. מוצגים שני פרוטוקולים שלב אחר שלב להכללה ובדיקה של תגובות CFPS בהידרוג'לים. ראשית, ניתן לשלב מערכת CFPS בהידרוג'ל באמצעות התייבשות עם ליזט תא. לאחר מכן ניתן להשרות או לבטא את המערכת בתוך ההידרוג'ל באופן קונסטיטוטיבי לביטוי חלבוני מלא באמצעות ההידרוג'ל. שנית, ניתן להחדיר לליזט התא הידרוג'ל בנקודת הפילמור, וניתן לייבש את המערכת כולה בהקפאה ולהתייבש מחדש בנקודה מאוחרת יותר באמצעות תמיסה מימית המכילה את השראת מערכת הביטוי המקודדת בתוך ההידרוג'ל. לשיטות אלה יש פוטנציאל לאפשר רשתות גנים נטולות תאים המקנות יכולות חושיות לחומרי הידרוג'ל, עם פוטנציאל לפריסה מעבר למעבדה.

ביולוגיה סינתטית משלבת דיסציפלינות הנדסיות מגוונות כדי לתכנן ולהנדס חלקים, התקנים ומערכות מבוססי ביולוגיה שיכולים לבצע פונקציות שאינן נמצאות בטבע. רוב גישות הביולוגיה הסינתטית עדיין קשורות לתאים חיים. לעומת זאת, מערכות ביולוגיה סינתטית נטולות תאים מאפשרות רמות חסרות תקדים של שליטה וחופש בתכנון, ומאפשרות גמישות מוגברת וקיצור זמן להנדסת מערכות ביולוגיות תוך ביטול רבים מהאילוצים של שיטות מסורתיות לביטוי גנים מבוססי תאים 1,2,3. CFPS נמצא בשימוש במספר גדל והולך של יישומים על פני דיסציפלינות רבות, כולל בניית תאים מלאכותיים, אב טיפוס של מעגלים גנטיים, פיתוח biosensors, וייצור מטבולי....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. חיץ ליזט תאים והכנת מדיה

  1. הכנת אגר YT+P 2x ובינוני
    1. הכינו אגר YT+P 2x על ידי מדידת 16 גרם/ליטר טריפטון, תמצית שמרים 10 גרם/ליטר, 5 גרם/ליטר NaCl, 40 מ"ל/ליטר, 1 M K 2, HPO 4, 22 מ"ל/ליטר, 1 M KH2PO4 ו-15 גרם/ליטר אגר. למרק YT+P 2x, עקבו אחר הרכב הקודם אך השמיטו את האגר.
    2. עיקור על י.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות להטמעת תגובות CFPS במטריצות הידרוג'ל, כאשר איור 1 מציג סקירה סכמטית של שתי הגישות. שתי השיטות מקובלות לייבוש בהקפאה ואחסון לטווח ארוך. שיטה א' היא המתודולוגיה הנפוצה ביותר משתי סיבות. ראשית, היא הוכחה כשיטה הישימה ביותר לעבודה עם מגוון חומרי הידרוג'ל.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

להלן שני פרוטוקולים לשילוב תגובות CFPS מבוססות תאי E. coli ליזט בהידרוג'לים של אגרוז. שיטות אלו מאפשרות ביטוי גנים בו זמנית בכל החומר. ניתן להתאים את הפרוטוקול למערכות CFPS אחרות והוא נערך בהצלחה עם ערכות CFPS זמינות מסחרית בנוסף לליזטים התאיים שהוכנו במעבדה המפורטים כאן. חשוב לציין כי הפרוטו?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המחברים מודים מאוד על תמיכתם של פרסי מועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) ו- BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), ופרס EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H). נתונים התומכים בפרסום זה זמינים באופן גלוי בכתובת: 10.25405/data.ncl.22232452. לצורך גישה פתוחה, המחבר החיל רישיון Creative Commons Attribution (CC BY) על כל גרסה של כתב היד המקובל על המחבר.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
3-PGASanta Cruz Biotechnologysc-214793B
Acetic AcidSigma-AldrichA6283
AgarThermo Fisher ScientificA10752.22
AgaroseSevern Biotech30-15-50
Amino Acid Sampler KitVWRBTRABR1401801
ATPSigma-AldrichA8937-1G
cAMPSigma-AldrichA9501-1G
Coenzyme A (CoA)Sigma-AldrichC4282-100MG
CTPAlfa AesarJ14121.MC
DTTThermo Fisher ScientificR0862
Folinic AcidSigma-AldrichF7878-100MG
GTPCarbosynthNG01208
HEPESSigma-AldrichH4034-25G
K-glutamateSigma-AldrichG1149-100G
LysozymeSigma-AldrichL6876-1G
Mg-glutamateSigma-Aldrich49605-250G
NADSigma-AldrichN6522-250MG
PEG-8000PromegaV3011
Potassium Hydroxide (KOH)Sigma-Aldrich757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichRDD037-500G
Protease Inhibitor cocktailSigma-AldrichP2714-1BTL
Qubit Protein concentration kitThermo Fisher ScientificA50668
Rossetta 2 DE 3 E.coliSigma-Aldrich71397-3
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888-500G
SpermidineSigma-Aldrich85558-1G
TryptoneThermo Fisher Scientific211705
TrisSigma-AldrichGE17-1321-01
tRNASigma-Aldrich10109541001
UTPAlfa AesarJ23160.MC
Yeast ExtractSigma-AldrichY1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubesSigma-AldrichHS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettesThermo Fisher Scientific66381
15 mL centrifuge tubeSarstedt62.554.502
50 mL centrifuge bottlesSarstedt62.547.254
500 mL centrifuge bottlesThermo Fisher Scientific3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryerChristpart no. 101521, 101522, 101527
Benchtop CentrifugeThermo Fisher ScientificH-X3R
Black 384 well microtitre platesFischer Scientific66
CuvettesThermo Fisher Scientific222S
Elga Purelab ChorusElga#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425REppendorfEP00532
High Speed CentrifugeBeckman CoulterB34183
JMP licenseSAS Institute15
Magnetic StirrerFischer Scientific15353518
ParafilmAmcorPM-966
Photospectrometer (Biophotometer)Eppendorf16713
Pipettes and tipsGilson#####
Precision BalanceSartorius16384738
Qubit 2.0 FluorometerThermo Fisher ScientificQ32866
Shaking IncubatorThermo Fisher ScientificSHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)Thermo Fisher Scientific12893543
Static IncubatorSanyoMIR-162
Syringe and needlesThermo Fisher Scientific66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)Thermo Fisher ScientificSHKE8000
Varioskan Lux platereaderThermo Fisher ScientificVLBL00GD1
Vortex Genie 2Cole-parmerOU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meterVWR662-1657

  1. Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
  2. Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).
  3. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  4. Kopniczky, M. B., et al. Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).
  5. Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).
  6. Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).
  7. Focke, P. J., et al. Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression. Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).
  8. Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., Böckmann, A. Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).
  9. Bashir, S., et al. Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications. Polymers. 12 (11), 2702 (2020).
  10. Loo, S. L., Vásquez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future. Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).
  11. Whitfield, C. J., et al. Cell-free protein synthesis in hydrogel materials. Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).
  12. Yao, H., et al. Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends. Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).
  13. Musgrave, C. S. A., Fang, F. Contact lens materials: A materials science perspective. Materials. 12 (2), 261 (2019).
  14. Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management. Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).
  15. Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques. Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).
  16. Jacob, S., et al. Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management. Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).
  17. Senapati, S., et al. Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance. Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).
  18. Chen, Y., et al. A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds. Molecules. 25 (13), 3050 (2020).
  19. Shi, Q., et al. Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications. NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).
  20. Fan, M., Tan, H. Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds. Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).
  21. Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix. Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).
  22. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  23. Huang, A., et al. BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).
  24. Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., García-Guzmán, J. A. Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine. Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).
  25. Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications. Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).
  26. Salati, M. A., et al. Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering. Polymers. 12 (5), 1150 (2020).
  27. Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).
  28. Kahn, J. S., et al. DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display. Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).
  29. Yang, D., et al. Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution. Scientific Reports. 3, 3165 (2013).
  30. Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells. Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).
  31. Whitfield, C. J., et al. Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels. BioRxiv. , (2019).
  32. Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications. Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).
  33. Howard, T., et al. Datasets for Whitfield et al. 2020 Chemical Communications. , (2020).
  34. Banks, A. M., et al. Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).
  35. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
  36. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  37. Benítez-Mateos, A. I., et al. Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel µ-channels. ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved