Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
यहां, हम बाहरी तरल चरण की आवश्यकता के बिना मैक्रो-स्केल हाइड्रोगेल मैट्रिसेस में सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने के लिए दो प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
सिंथेटिक जीन नेटवर्क वैज्ञानिकों और इंजीनियरों को आनुवंशिक स्तर पर एन्कोड की गई कार्यक्षमता के साथ नई प्रणालियों को डिजाइन और निर्माण करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैं। जबकि जीन नेटवर्क की तैनाती के लिए प्रमुख प्रतिमान एक सेलुलर चेसिस के भीतर है, सिंथेटिक जीन नेटवर्क को सेल-मुक्त वातावरण में भी तैनात किया जा सकता है। सेल-मुक्त जीन नेटवर्क के आशाजनक अनुप्रयोगों में बायोसेंसर शामिल हैं, क्योंकि इन उपकरणों को जैविक (इबोला, जीका और सार्स-सीओवी-2 वायरस) और अजैविक (भारी धातु, सल्फाइड, कीटनाशक, और अन्य कार्बनिक संदूषक) लक्ष्यों के खिलाफ प्रदर्शित किया गया है। सेल-फ्री सिस्टम आमतौर पर एक प्रतिक्रिया पोत के भीतर तरल रूप में तैनात होते हैं। एक भौतिक मैट्रिक्स में ऐसी प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने में सक्षम होने के नाते, हालांकि, वातावरण के व्यापक सेट में उनके व्यापक अनुप्रयोग की सुविधा हो सकती है। इसके लिए, विभिन्न प्रकार के हाइड्रोगेल मैट्रिसेस में सेल-मुक्त प्रोटीन संश्लेषण (सीएफपीएस) प्रतिक्रियाओं को एम्बेड करने के तरीके विकसित किए गए हैं। इस काम के लिए अनुकूल हाइड्रोगेल के प्रमुख गुणों में से एक हाइड्रोगेल सामग्री की उच्च-जल पुनर्गठन क्षमता है। इसके अतिरिक्त, हाइड्रोगेल में भौतिक और रासायनिक विशेषताएं होती हैं जो कार्यात्मक रूप से फायदेमंद होती हैं। हाइड्रोगेल को भंडारण के लिए फ्रीज-सुखाया जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए पुनर्जलीकृत किया जा सकता है। हाइड्रोगेल में सीएफपीएस प्रतिक्रियाओं के समावेश और परख के लिए दो चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए गए हैं। सबसे पहले, एक सीएफपीएस प्रणाली को सेल लाइसेट के साथ पुनर्जलीकरण के माध्यम से हाइड्रोगेल में शामिल किया जा सकता है। हाइड्रोगेल के भीतर की प्रणाली को हाइड्रोगेल के माध्यम से पूर्ण प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित या संवैधानिक रूप से व्यक्त किया जा सकता है। दूसरा, सेल लाइसेट को पोलीमराइजेशन के बिंदु पर एक हाइड्रोगेल में पेश किया जा सकता है, और पूरे सिस्टम को बाद में हाइड्रोगेल के भीतर एन्कोड किए गए अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए इंड्यूसर युक्त जलीय घोल के साथ फ्रीज-सुखाया और पुनर्जलीकृत किया जा सकता है। इन विधियों में सेल-मुक्त जीन नेटवर्क की अनुमति देने की क्षमता है जो प्रयोगशाला से परे तैनाती की क्षमता के साथ हाइड्रोगेल सामग्री को संवेदी क्षमताएं प्रदान करते हैं।
सिंथेटिक जीव विज्ञान जैविक रूप से आधारित भागों, उपकरणों और प्रणालियों को डिजाइन और इंजीनियर करने के लिए विविध इंजीनियरिंग विषयों को एकीकृत करता है जो उन कार्यों को कर सकते हैं जो प्रकृति में नहीं पाए जाते हैं। अधिकांश सिंथेटिक जीव विज्ञान दृष्टिकोण अभी भी जीवित कोशिकाओं से बंधे हैं। इसके विपरीत, सेल-मुक्त सिंथेटिक जीव विज्ञान प्रणाली डिजाइन में नियंत्रण और स्वतंत्रता के अभूतपूर्व स्तर की सुविधा प्रदान करती है, जिससे पारंपरिक सेल-आधारित जीनअभिव्यक्ति विधियों 1,2,3 की कई बाधाओं को समाप्त करते हुए इंजीनियरिंग जैविक प्रणालियों के लिए लचीलापन और कम समय में वृद्धि होती है। सीएफपीएस....
1. सेल लाइसेट बफर और मीडिया तैयारी
लेखक जैव प्रौद्योगिकी और जैविक विज्ञान अनुसंधान परिषद पुरस्कार बीबी/V017551/1 (एस.के., टी.पी.एच.) और बीबी/W01095X/1 (ए.एल., टी.पी.एच.) और इंजीनियरिंग और भौतिक विज्ञान अनुसंधान परिषद - रक्षा विज्ञान और प्रौद्योगिकी प्रयोगशालाएं पुरस्कार ईपी/N026683/1 (सी.जे.डब्ल्यू., ए.एम.बी., टी.पी.एच.) के समर्थन को स्वीकार करते हैं। इस प्रकाशन का समर्थन करने वाले डेटा खुले तौर पर उपलब्ध हैं: 10.25405/ data.ncl.22232452. खुली पहुंच के उद्देश्य से, लेखक ने उत्पन्न होने वाले किसी भी लेखक स्वीकृत पांडुलिपि संस्करण के लिए क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन (सीसी बीवाई) लाइसेंस लागू किया है।
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Material | |||
3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
GTP | Carbosynth | NG01208 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
PEG-8000 | Promega | V3011 | |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
Equipment | |||
1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
JMP license | SAS Institute | 15 | |
Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
Parafilm | Amcor | PM-966 | |
Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
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