マクロスケールハイドロゲルへの無細胞タンパク質合成反応の埋め込み法

ここでは、外液相を必要とせずに、無細胞タンパク質合成反応をマクロスケールのヒドロゲルマトリックスに組み込むための2つのプロトコルを紹介します。

合成遺伝子ネットワークは、科学者やエンジニアが遺伝子レベルでエンコードされた機能を備えた新しいシステムを設計および構築するためのプラットフォームを提供します。遺伝子ネットワークの展開のための支配的なパラダイムは細胞シャーシ内にありますが、合成遺伝子ネットワークは無細胞環境でも展開できます。無細胞遺伝子ネットワークの有望な用途には、バイオセンサーが含まれ、これらのデバイスは生物(エボラ、ジカ、およびSARS-CoV-2ウイルス)および非生物的(重金属、硫化物、農薬、およびその他の有機汚染物質)の標的に対して実証されています。無細胞システムは通常、反応容器内に液体の形で展開されます。しかし、このような反応を物理マトリックスに埋め込むことができれば、より広い環境でのより広範な適用が容易になる可能性があります。この目的のために、無細胞タンパク質合成(CFPS)反応を様々なヒドロゲルマトリックスに組み込む方法が開発されている。この作業に役立つヒドロゲルの重要な特性の1つは、ヒドロゲル材料の高い水再構成能力です。さらに、ヒドロゲルは、機能的に有益な物理的および化学的特性を有する。ヒドロゲルは、貯蔵のために凍結乾燥し、後で使用するために再水和することができる。ヒドロゲルにCFPS反応を含めることとアッセイするための2つの段階的なプロトコルが提示されます。まず、CFPSシステムは、細胞ライセートによる再水和 を介して ヒドロゲルに組み込むことができます。次いで、ヒドロゲル内の系を構成的に誘導または発現させて、ヒドロゲルを介した完全なタンパク質発現を得ることができる。第2に、細胞ライセートを重合時点でヒドロゲルに導入することができ、システム全体を凍結乾燥し、ヒドロゲル内にコードされた発現系の誘導物質を含む水溶液で後で再水和することができる。これらの方法は、ヒドロゲル材料に感覚能力を付与する無細胞遺伝子ネットワークを可能にする可能性があり、実験室を超えて展開する可能性があります。

合成生物学は、多様な工学分野を統合して、自然界には見られない機能を実行できる生物学的ベースの部品、デバイス、およびシステムを設計およびエンジニアリングします。ほとんどの合成生物学のアプローチは、依然として生細胞に結びついています。対照的に、無細胞合成生物学システムは、前例のないレベルの制御と設計の自由度を促進し、従来の細胞ベースの遺伝子発現法の制約の多くを排除しながら、生物学的システムのエンジニアリングの柔軟性を高め、時間を短縮します^1,2,3。CFPSは、人工細胞の構築、遺伝子回路のプロトタイピング、バイオセンサーの開発、代謝物の生成など、多くの分野でますます多くのアプリケーションで使用されています^4,5,6。CFPSは、凝集しやすいタンパク質、膜貫通タンパク質、毒性タンパク質など、生細胞では容易に発現できない組換えタンパク質の産生にも特に有用です^6,7,8。

1. 細胞ライセートバッファーおよび培地調製

1. 2x YT+P寒天培地の調製
   1. 16 g/L トリプトン、10 g/L 酵母エキス、5 g/L NaCl、40 mL/L 1 M K 2 HPO 4、22 mL/L 1 M KH₂PO₄、および 15 g/L 寒天を測定して、2x YT+P寒天を調製します。2x YT + Pブロスの場合は、前の組成に従いますが、寒天は省略します。
   2. 2x YT+Pをオートクレーブして滅菌します。

このプロトコルでは、CFPS反応をヒドロゲルマトリックスに組み込むための2つの方法について詳しく説明しており、 図1 は2つのアプローチの概略的な概要を示しています。どちらの方法も凍結乾燥と長期保存に適しています。方法Aは、2つの理由から最も利用されている方法です。第1に、ある範囲のヒドロゲル材料¹¹を扱うための最も適用可能な方法?.......

ここでは、 大腸菌 細胞ライセートベースのCFPS反応をアガロースヒドロゲルに組み込むための2つのプロトコルについて概説します。これらの方法は、材料全体で同時に遺伝子発現を可能にします。このプロトコルは、他のCFPSシステムにも適用でき、ここで詳しく説明する実験室で調製された細胞ライセートに加えて、市販のCFPSキットを使用して成功裏に実施されています。重要なこ?.......

著者らは、バイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会賞BB/V017551/1(S.K.、T.P.H.)およびBB/W01095X/1(A.L.、T.P.H.)、および工学物理科学研究評議会-防衛科学技術研究所賞EP/N026683/1(C.J.W.、A.M.B.、T.P.H.)の支援に大いに感謝しています。この出版物を裏付けるデータは、10.25405/data.ncl.22232452で公開されています。オープンアクセスの目的で、著者は、著者が受理した原稿のバージョンにクリエイティブコモンズ表示(CC BY)ライセンスを適用しています。