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Biology

거시적 규모의 하이드로겔에 cell-free 단백질 합성 반응을 임베딩하는 방법

Published: June 23rd, 2023

DOI:

10.3791/65500

1School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 2Department of Life Sciences, Imperial College London
* These authors contributed equally

여기에서 우리는 외부 액상 없이 매크로 스케일 하이드로겔 매트릭스에 cell-free 단백질 합성 반응을 포함하기 위한 두 가지 프로토콜을 제시합니다.

합성 유전자 네트워크는 과학자와 엔지니어가 유전자 수준에서 인코딩된 기능을 갖춘 새로운 시스템을 설계하고 구축할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 유전자 네트워크 배치에 대한 지배적인 패러다임은 세포 섀시 내에 있지만 합성 유전자 네트워크는 무세포 환경에도 배치될 수 있습니다. 무세포 유전자 네트워크의 유망한 응용 분야에는 바이오센서가 포함되며, 이러한 장치는 생물(에볼라, 지카 및 SARS-CoV-2 바이러스) 및 비생물적(중금속, 황화물, 살충제 및 기타 유기 오염 물질) 표적에 대해 입증되었습니다. Cell-free 시스템은 일반적으로 반응 용기 내에 액체 형태로 배치됩니다. 그러나 이러한 반응을 물리적 매트릭스에 포함시킬 수 있으면 더 넓은 환경에서 더 광범위한 적용을 용이하게 할 수 있습니다. 이를 위해, 다양한 하이드로겔 매트릭스에 무세포 단백질 합성(cell-free protein synthesis, CFPS) 반응을 내장하는 방법들이 개발되었다. 이 작업에 도움이 되는 하이드로겔의 주요 특성 중 하나는 하이드로겔 재료의 고수위 재구성 능력입니다. 또한 하이드로겔은 기능적으로 유익한 물리적, 화학적 특성을 가지고 있습니다. 하이드로겔은 저장을 위해 동결 건조하고 나중에 사용하기 위해 재수화할 수 있습니다. 하이드로겔에 CFPS 반응을 포함시키고 분석하기 위한 두 가지 단계별 프로토콜이 제시됩니다. 첫째, CFPS 시스템은 세포 용해물로 재수화를 통해 하이드로겔에 통합될 수 있습니다. 이어서, 하이드로겔 내의 시스템은 하이드로겔을 통해 완전한 단백질 발현을 위해 구성적으로 유도 또는 발현될 수 있다. 둘째, 세포 용해물은 중합 시점에서 하이드로겔에 도입될 수 있고, 전체 시스템은 하이드로겔 내에서 코딩되는 발현 시스템을 위한 유도제를 함유하는 수용액으로 동결건조 및 추후 시점에서 재수화될 수 있다. 이러한 방법은 하이드로겔 물질에 감각 기능을 부여하는 무세포 유전자 네트워크를 허용할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며 실험실 외부로 배포할 수 있습니다.

합성 생물학은 다양한 공학 분야를 통합하여 자연에서 볼 수 없는 기능을 수행할 수 있는 생물학적 기반 부품, 장치 및 시스템을 설계하고 엔지니어링합니다. 대부분의 합성 생물학 접근법은 여전히 살아있는 세포에 묶여 있습니다. 대조적으로, cell-free 합성 생물학 시스템은 전례 없는 수준의 제어와 설계의 자유를 촉진하여 전통적인 세포 기반 유전자 발현 방법 1,2,3의 많은 제약을 제거하면서 생물학적 시스템 엔지니어링을 위한 유연성을 높이고 시간을 단축할 수 있습니다. CFPS는 인공 세포 구성, 유전 회로 프로토타이핑, 바이오센서 개발, 대사산물 생산 등 다양한 분야에서 점점 더 많은 응용 분야에서 사용되고 있습니다 4,5,6. CFPS는 또한 응집되기 쉬운 단백질, 막횡단 단백질 및 독성 단백질 6,7,8과 같이 살아있는 세포에서 쉽게 발현될 수 없는 ....

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1. 세포 용해물 완충액 및 배지 준비

  1. 2x YT+P 한천 및 배지의 제조
    1. 16g/L 트립톤, 10g/L 효모 추출물, 5g/L NaCl, 40mL/L 1M K 2HPO 4, 22mL/L 1M KH 2PO4 및 15g/L 한천을 측정하여2xYT+P 한천을 준비합니다. 2x YT+P 국물의 경우 이전 구성을 따르되 한천은 생략합니다.
    2. 2x YT+P를 고압증기멸균하여 살균합니다.
  2. S30A 버퍼의 제조
    1. 아세트산?.......

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이 프로토콜은 CFPS 반응을 하이드로겔 매트릭스에 삽입하는 두 가지 방법을 자세히 설명하며, 그림 1 은 두 가지 접근 방식에 대한 개략도를 보여줍니다. 두 방법 모두 동결 건조 및 장기 보관이 가능합니다. 방법 A는 두 가지 이유로 가장 많이 활용되는 방법론입니다. 첫째, 다양한 하이드로겔 물질(11)을 사용하는 데 가장 적합한 방법인 것으로 나타났다. ?.......

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여기에 요약된 것은 대장균 세포 용해물 기반 CFPS 반응을 아가로스 하이드로겔에 통합하기 위한 두 가지 프로토콜입니다. 이러한 방법은 물질 전체에 걸쳐 동시 유전자 발현을 허용합니다. 이 프로토콜은 다른 CFPS 시스템에 적용할 수 있으며 여기에 자세히 설명된 실험실에서 준비한 세포 용해물 외에도 상업적으로 이용 가능한 CFPS 키트를 사용하여 성공적으로 수행되었습니다. 중요하게도.......

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저자는 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회(Biotechnology and Biological Sciences Research Council) 상 BB/V017551/1(S.K., T.P.H.) 및 BB/W01095X/1(A.L., T.P.H.)과 공학 및 물리 과학 연구 위원회(Engineering and Physical Sciences Research Council) - 국방 과학 기술 연구소(Defense Science and Technology Laboratories) 상 EP/N026683/1(C.J.W., A.M.B., T.P.H.)의 지원을 크게 인정합니다. 이 간행물을 뒷받침하는 데이터는 10.25405/data.ncl.22232452에서 공개적으로 사용할 수 있습니다. 오픈 액세스를 위해 저자는 발생하는 모든 저자 수락 원고 버전에 CC BY(Creative Commons Attribution) 라이선스를 적용했습니다.

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
Material
3-PGASanta Cruz Biotechnologysc-214793B
Acetic AcidSigma-AldrichA6283
AgarThermo Fisher ScientificA10752.22
AgaroseSevern Biotech30-15-50
Amino Acid Sampler KitVWRBTRABR1401801
ATPSigma-AldrichA8937-1G
cAMPSigma-AldrichA9501-1G
Coenzyme A (CoA)Sigma-AldrichC4282-100MG
CTPAlfa AesarJ14121.MC
DTTThermo Fisher ScientificR0862
Folinic AcidSigma-AldrichF7878-100MG
GTPCarbosynthNG01208
HEPESSigma-AldrichH4034-25G
K-glutamateSigma-AldrichG1149-100G
LysozymeSigma-AldrichL6876-1G
Mg-glutamateSigma-Aldrich49605-250G
NADSigma-AldrichN6522-250MG
PEG-8000PromegaV3011
Potassium Hydroxide (KOH)Sigma-Aldrich757551-5G
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)Sigma-AldrichP3786-500G
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)Sigma-AldrichRDD037-500G
Protease Inhibitor cocktailSigma-AldrichP2714-1BTL
Qubit Protein concentration kitThermo Fisher ScientificA50668
Rossetta 2 DE 3 E.coliSigma-Aldrich71397-3
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888-500G
SpermidineSigma-Aldrich85558-1G
TryptoneThermo Fisher Scientific211705
TrisSigma-AldrichGE17-1321-01
tRNASigma-Aldrich10109541001
UTPAlfa AesarJ23160.MC
Yeast ExtractSigma-AldrichY1625-1KG
Equipment
1.5 mL microcentrifuge tubesSigma-AldrichHS4323-500EA
10K MWCO dialysis cassettesThermo Fisher Scientific66381
15 mL centrifuge tubeSarstedt62.554.502
50 mL centrifuge bottlesSarstedt62.547.254
500 mL centrifuge bottlesThermo Fisher Scientific3120-9500
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryerChristpart no. 101521, 101522, 101527
Benchtop CentrifugeThermo Fisher ScientificH-X3R
Black 384 well microtitre platesFischer Scientific66
CuvettesThermo Fisher Scientific222S
Elga Purelab ChorusElga#####
Eppendorf Microcentrifuge 5425REppendorfEP00532
High Speed CentrifugeBeckman CoulterB34183
JMP licenseSAS Institute15
Magnetic StirrerFischer Scientific15353518
ParafilmAmcorPM-966
Photospectrometer (Biophotometer)Eppendorf16713
Pipettes and tipsGilson#####
Precision BalanceSartorius16384738
Qubit 2.0 FluorometerThermo Fisher ScientificQ32866
Shaking IncubatorThermo Fisher ScientificSHKE8000
Sonic Dismembrator (Sonicator)Thermo Fisher Scientific12893543
Static IncubatorSanyoMIR-162
Syringe and needlesThermo Fisher Scientific66490
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)Thermo Fisher ScientificSHKE8000
Varioskan Lux platereaderThermo Fisher ScientificVLBL00GD1
Vortex Genie 2Cole-parmerOU-04724-05
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meterVWR662-1657

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