Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Her presenterer vi to protokoller for å legge inn cellefrie proteinsyntesereaksjoner i makroskala hydrogelmatriser uten behov for en ekstern væskefase.
Syntetiske gennettverk gir en plattform for forskere og ingeniører til å designe og bygge nye systemer med funksjonalitet kodet på genetisk nivå. Mens det dominerende paradigmet for distribusjon av gennettverk er innenfor et cellulært chassis, kan syntetiske gennettverk også distribueres i cellefrie miljøer. Lovende anvendelser av cellefrie gennettverk inkluderer biosensorer, da disse enhetene har blitt demonstrert mot biotiske (Ebola, Zika og SARS-CoV-2-virus) og abiotiske (tungmetaller, sulfider, plantevernmidler og andre organiske forurensninger) mål. Cellefrie systemer er vanligvis distribuert i flytende form i et reaksjonsbeholder. Å kunne legge inn slike reaksjoner i en fysisk matrise kan imidlertid lette deres bredere anvendelse i et bredere sett av miljøer. For dette formål har metoder for å legge inn cellefrie proteinsyntesereaksjoner (CFPS) i en rekke hydrogelmatriser blitt utviklet. En av de viktigste egenskapene til hydrogeler som bidrar til dette arbeidet, er høyvannsrekonstitueringskapasiteten til hydrogelmaterialer. I tillegg har hydrogeler fysiske og kjemiske egenskaper som er funksjonelt fordelaktige. Hydrogeler kan frysetørkes for lagring og rehydreres for senere bruk. To trinnvise protokoller for inkludering og analyse av CFPS-reaksjoner i hydrogeler presenteres. For det første kan et CFPS-system inkorporeres i en hydrogel via rehydrering med et cellelysat. Systemet i hydrogelen kan deretter induseres eller uttrykkes konstitutivt for fullstendig proteinekspresjon gjennom hydrogelen. For det andre kan cellelysat innføres til en hydrogel ved polymerisasjonspunktet, og hele systemet kan frysetørkes og rehydreres på et senere tidspunkt med en vandig oppløsning som inneholder induktoren for ekspresjonssystemet kodet i hydrogelen. Disse metodene har potensial til å tillate cellefrie gennettverk som gir sensoriske evner til hydrogelmaterialer, med potensial for distribusjon utenfor laboratoriet.
Syntetisk biologi integrerer ulike ingeniørdisipliner for å designe og konstruere biologisk baserte deler, enheter og systemer som kan utføre funksjoner som ikke finnes i naturen. De fleste syntetiske biologiske tilnærminger er fortsatt bundet til levende celler. I motsetning til dette muliggjør cellefrie syntetiske biologiske systemer enestående nivåer av kontroll og frihet i design, noe som muliggjør økt fleksibilitet og forkortet tid for ingeniørbiologiske systemer, samtidig som mange av begrensningene i tradisjonelle cellebaserte genuttrykksmetoderelimineres 1,2,3. CFPS b....
1. Cellelysatbuffer og mediepreparasjon
Denne protokollen beskriver to metoder for å legge inn CFPS-reaksjoner i hydrogelmatriser, med figur 1 som presenterer en skjematisk oversikt over de to tilnærmingene. Begge metodene er egnet til frysetørking og langtidslagring. Metode A er den mest brukte metodikken av to grunner. For det første har det vist seg å være den mest anvendelige metoden for arbeid med en rekke hydrogelmaterialer11. For det andre tillater metode A parallell testing av genetiske konst.......
Skissert her er to protokoller for inkorporering av E. coli-cellelysatbaserte CFPS-reaksjoner i agarosehydrogeler . Disse metodene tillater samtidig genuttrykk gjennom hele materialet. Protokollen kan tilpasses for andre CFPS-systemer og har blitt utført med kommersielt tilgjengelige CFPS-sett i tillegg til de laboratoriepreparerte cellelysatene som er beskrevet her. Det er viktig at protokollen tillater genuttrykk i fravær av en ekstern væskefase. Dette betyr at systemet er selvstendig og ikke krever et cell.......
Forfatterne anerkjenner i stor grad støtten fra Biotechnology and Biological Sciences Research Council awards BB / V017551 / 1 (S.K., T.P.H.) og BB / W01095X / 1 (AL, TPH), og Engineering and Physical Sciences Research Council - Defence Science and Technology Laboratories award EP / N026683 / 1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Data som støtter denne publikasjonen er åpent tilgjengelig på: 10.25405/data.ncl.22232452. For åpen tilgang har forfatteren anvendt en Creative Commons Attribution (CC BY)-lisens på enhver forfatterakseptert manuskriptversjon som oppstår.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Material | |||
3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
GTP | Carbosynth | NG01208 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
PEG-8000 | Promega | V3011 | |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
Equipment | |||
1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
JMP license | SAS Institute | 15 | |
Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
Parafilm | Amcor | PM-966 | |
Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved