Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Aqui, apresentamos dois protocolos para incorporar reações de síntese proteica livre de células em matrizes de hidrogel em macroescala sem a necessidade de uma fase líquida externa.
As redes genéticas sintéticas fornecem uma plataforma para cientistas e engenheiros projetarem e construírem novos sistemas com funcionalidade codificada em nível genético. Enquanto o paradigma dominante para a implantação de redes gênicas está dentro de um chassi celular, redes gênicas sintéticas também podem ser implantadas em ambientes livres de células. Aplicações promissoras de redes gênicas livres de células incluem biossensores, já que esses dispositivos foram demonstrados contra alvos bióticos (vírus Ebola, Zika e SARS-CoV-2) e abióticos (metais pesados, sulfetos, pesticidas e outros contaminantes orgânicos). Sistemas livres de células são tipicamente implantados na forma líquida dentro de um vaso de reação. Ser capaz de incorporar tais reações em uma matriz física, no entanto, pode facilitar sua aplicação mais ampla em um conjunto mais amplo de ambientes. Para este fim, métodos para incorporar reações de síntese proteica livre de células (CFPS) em uma variedade de matrizes de hidrogel têm sido desenvolvidos. Uma das principais propriedades dos hidrogéis propícios a este trabalho é a alta capacidade de reconstituição de água dos materiais hidrogéis. Além disso, os hidrogéis possuem características físicas e químicas funcionalmente benéficas. Os hidrogéis podem ser liofilizados para armazenamento e reidratados para uso posterior. Dois protocolos passo-a-passo para a inclusão e ensaio de reações de CFPS em hidrogéis são apresentados. Primeiro, um sistema CFPS pode ser incorporado a um hidrogel via reidratação com um lisado celular. O sistema dentro do hidrogel pode então ser induzido ou expresso constitutivamente para a expressão completa de proteínas através do hidrogel. Em segundo lugar, o lisado celular pode ser introduzido em um hidrogel no ponto de polimerização, e todo o sistema pode ser liofilizado e reidratado em um ponto posterior com uma solução aquosa contendo o indutor para o sistema de expressão codificado dentro do hidrogel. Esses métodos têm o potencial de permitir redes gênicas livres de células que conferem capacidades sensoriais a materiais hidrogéis, com potencial para implantação além do laboratório.
A biologia sintética integra diversas disciplinas de engenharia para projetar e projetar peças, dispositivos e sistemas de base biológica que podem executar funções que não são encontradas na natureza. A maioria das abordagens da biologia sintética ainda está ligada a células vivas. Por outro lado, sistemas de biologia sintética livres de células facilitam níveis sem precedentes de controle e liberdade no projeto, permitindo maior flexibilidade e um tempo reduzido para a engenharia de sistemas biológicos, ao mesmo tempo em que eliminam muitas das restrições dos métodos tradicionais de expressão gênica baseados em células
1. Tampão de lisado celular e preparação do meio
Este protocolo detalha dois métodos para incorporar reações de CFPS em matrizes de hidrogel, com a Figura 1 apresentando uma visão geral esquemática das duas abordagens. Ambos os métodos são passíveis de liofilização e armazenamento a longo prazo. O método A é a metodologia mais utilizada por dois motivos. Primeiro, mostrou-se o método mais aplicável para trabalhar com uma variedade de materiais hidrogéis11. Em segundo lugar, o método A permite o test.......
Aqui são descritos dois protocolos para a incorporação de reações CFPS baseadas em lisado celular de E. coli em hidrogéis de agarose. Esses métodos permitem a expressão gênica simultânea em todo o material. O protocolo pode ser adaptado para outros sistemas CFPS e tem sido conduzido com sucesso com kits CFPS disponíveis comercialmente, além dos lisados celulares preparados em laboratório detalhados aqui. É importante ressaltar que o protocolo permite a expressão gênica na ausência de uma fase l?.......
Os autores agradecem imensamente o apoio dos prêmios BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) e BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) e EP/N026683/1 (A.L., T.P.H.) do Conselho de Pesquisa em Engenharia e Ciências Físicas - Laboratórios de Ciência e Tecnologia de Defesa (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Os dados que suportam esta publicação estão disponíveis em: 10.25405/data.ncl.22232452. Para fins de acesso aberto, o autor aplicou uma licença Creative Commons Attribution (CC BY) a qualquer versão do Autor Aceito do Manuscrito que surgir.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Material | |||
3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
Agarose | Severn Biotech | 30-15-50 | |
Amino Acid Sampler Kit | VWR | BTRABR1401801 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
Coenzyme A (CoA) | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
GTP | Carbosynth | NG01208 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
PEG-8000 | Promega | V3011 | |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
Protease Inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
Qubit Protein concentration kit | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
Rossetta 2 DE 3 E.coli | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
Tryptone | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
Equipment | |||
1.5 mL microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
10K MWCO dialysis cassettes | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
15 mL centrifuge tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
50 mL centrifuge bottles | Sarstedt | 62.547.254 | |
500 mL centrifuge bottles | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer | Christ | part no. 101521, 101522, 101527 | |
Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
Black 384 well microtitre plates | Fischer Scientific | 66 | |
Cuvettes | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
Elga Purelab Chorus | Elga | ##### | |
Eppendorf Microcentrifuge 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | B34183 | |
JMP license | SAS Institute | 15 | |
Magnetic Stirrer | Fischer Scientific | 15353518 | |
Parafilm | Amcor | PM-966 | |
Photospectrometer (Biophotometer) | Eppendorf | 16713 | |
Pipettes and tips | Gilson | ##### | |
Precision Balance | Sartorius | 16384738 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
Shaking Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
Sonic Dismembrator (Sonicator) | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
Static Incubator | Sanyo | MIR-162 | |
Syringe and needles | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
Thermo max Q8000 (Shaking Incubator) | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
Varioskan Lux platereader | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
Vortex Genie 2 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/°c meter | VWR | 662-1657 |
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