Metoder för att bädda in cellfria proteinsyntesreaktioner i hydrogeler på makronivå

Här presenterar vi två protokoll för att bädda in cellfria proteinsyntesreaktioner i hydrogelmatriser på makroskala utan behov av en extern vätskefas.

Syntetiska gennätverk ger en plattform för forskare och ingenjörer att designa och bygga nya system med funktionalitet kodad på genetisk nivå. Medan det dominerande paradigmet för utbyggnaden av gennätverk ligger inom ett cellulärt chassi, kan syntetiska gennätverk också användas i cellfria miljöer. Lovande tillämpningar av cellfria gennätverk inkluderar biosensorer, eftersom dessa enheter har demonstrerats mot biotiska (Ebola, Zika och SARS-CoV-2-virus) och abiotiska (tungmetaller, sulfider, bekämpningsmedel och andra organiska föroreningar) mål. Cellfria system används vanligtvis i flytande form i ett reaktionskärler. Att kunna bädda in sådana reaktioner i en fysisk matris kan dock underlätta deras bredare tillämpning i en bredare uppsättning miljöer. För detta ändamål har metoder för att bädda in cellfria proteinsyntesreaktioner (CFPS) i en mängd olika hydrogelmatriser utvecklats. En av de viktigaste egenskaperna hos hydrogeler som bidrar till detta arbete är hydrogelmaterialens höga vattenrekonstitutionskapacitet. Dessutom har hydrogeler fysikaliska och kemiska egenskaper som är funktionellt fördelaktiga. Hydrogeler kan frystorkas för lagring och återfuktas för användning senare. Två steg-för-steg-protokoll för inkludering och analys av CFPS-reaktioner i hydrogeler presenteras. För det första kan ett CFPS-system införlivas i en hydrogel via rehydrering med ett celllysat. Systemet i hydrogelen kan sedan induceras eller uttryckas konstitutivt för fullständigt proteinuttryck genom hydrogelen. För det andra kan celllysat introduceras till en hydrogel vid polymerisationspunkten, och hela systemet kan frystorkas och rehydreras vid ett senare tillfälle med en vattenlösning som innehåller induceraren för expressionssystemet som kodas i hydrogelen. Dessa metoder har potential att möjliggöra cellfria gennätverk som ger sensoriska förmågor till hydrogelmaterial, med potential för användning utanför laboratoriet.

Syntetisk biologi integrerar olika tekniska discipliner för att designa och konstruera biologiskt baserade delar, enheter och system som kan utföra funktioner som inte finns i naturen. De flesta metoder för syntetisk biologi är fortfarande bundna till levande celler. Cellfria system för syntetisk biologi möjliggör däremot oöverträffade nivåer av kontroll och frihet i designen, vilket möjliggör ökad flexibilitet och en förkortad tid för att konstruera biologiska system samtidigt som många av begränsningarna för traditionella cellbaserade genuttrycksmetoder elimineras ^1,2,3. CF....

1. Celllysatbuffert och medieberedning

1. Beredning av 2x YT+P-agar och medium
   1. Förbered 2x YT+P-agar genom att mäta upp 16 g/L trypton, 10 g/L jästextrakt, 5 g/L NaCl, 40 ml/L 1 M K 2 HPO 4, 22ml/L 1 M KH₂PO₄ och 15 g/L agar. För 2x YT+P-buljongen, följ den tidigare kompositionen men utelämna agar.
   2. Sterilisera genom autoklavering av 2x YT+P.
2. Beredning av S30A-bufferten
   1. Bered S30A-bufferten med 5,88 g/L.......

Detta protokoll beskriver två metoder för att bädda in CFPS-reaktioner i hydrogelmatriser, där figur 1 visar en schematisk översikt över de två tillvägagångssätten. Båda metoderna är mottagliga för frystorkning och långtidsförvaring. Metod A är den mest använda metoden av två skäl. För det första har det visat sig vara den mest tillämpliga metoden för att arbeta med en rad hydrogelmaterial¹¹. För det andra möjliggör metod A parallell testnin.......

Här beskrivs två protokoll för inkorporering av E. coli-celllysatbaserade CFPS-reaktioner i agaroshydrogeler . Dessa metoder möjliggör samtidig genuttryck i hela materialet. Protokollet kan anpassas för andra CFPS-system och har framgångsrikt genomförts med kommersiellt tillgängliga CFPS-kit utöver de laboratorieframställda celllysaten som beskrivs här. Viktigt är att protokollet tillåter genuttryck i frånvaro av en extern vätskefas. Detta innebär att systemet är fristående och inte kräver et.......

Författarna är mycket tacksamma för stödet från Biotechnology and Biological Sciences Research Council Awards BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) och BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.), och Engineering and Physical Sciences Research Council - Defence Science and Technology Laboratories award EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.). Data som stöder denna publikation är öppet tillgängliga på: 10.25405/data.ncl.22232452. För open access-ändamål har författaren tillämpat en Creative Commons Attribution (CC BY)-licens på alla Author Accepted Manuscript-versioner som uppstår.