ייצור ספרואידי גידול ואנקפסולציה בהידרוג'ל פוליאתילן גליקול לחקר אינטראקציות ספרואידים-מטריצה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר ייצור מהיר, חזק וזול של ספרואידים סרטניים ואחריו אנקפסולציה הידרוג'ל. זה ישים באופן נרחב כפי שהוא אינו דורש ציוד מיוחד. זה יהיה שימושי במיוחד לחקר אינטראקציות ספרואידים-מטריצה ובניית פיזיולוגיה של רקמות חוץ גופיות או מודלים פתולוגיים.

Abstract

אנקפסולציה תלת ממדית (3D) של ספרואידים חיונית כדי לשכפל כראוי את המיקרו-סביבה של הגידול לצמיחת תאים אופטימלית. כאן, תכננו מודל גליובלסטומה תלת-ממדי במבחנה עבור אנקפסולציה ספרואידית כדי לחקות את המיקרו-סביבה החוץ תאית של הגידול. ראשית, יצרנו תבניות מיקרווול פירמידליות מרובעות באמצעות polydimethylsiloxane. תבניות מיקרו-באר אלה שימשו לאחר מכן לייצור ספרואידים סרטניים בגדלים מבוקרים היטב בין 50-500 מיקרומטר. לאחר יצירת הספרואידים, הם נקטפו ונעטפו בהידרוג'לים מבוססי פוליאתילן גליקול (PEG). הידרוג'ל PEG הוא פלטפורמה רב-תכליתית לאנקפסולציה ספרואידית, מכיוון שניתן לכוונן תכונות הידרוג'ל כגון קשיחות, מתכלות והיצמדות תאים באופן עצמאי. כאן, השתמשנו בהידרוג'ל רך מייצג (~ 8 kPa) כדי לתמצת ספרואידים של גליובלסטומה. לבסוף, פותחה שיטה להכתמה ותמונה של ספרואידים לקבלת תמונות באיכות גבוהה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. בשל הליבה הספרואידית הצפופה והפריפריה הדלילה יחסית, הדמיה יכולה להיות קשה, אך שימוש בתמיסת ניקוי וחתך אופטי קונפוקלי מסייע להקל על קשיי הדמיה אלה. לסיכום, אנו מראים שיטה לייצר ספרואידים אחידים, לעטוף אותם בהידרוג'לים PEG ולבצע מיקרוסקופ קונפוקלי על הספרואידים העטופים כדי לחקור את גדילת הספרואידים ואינטראקציות שונות בין תאים למטריצה.

Introduction

ספרואידים סרטניים התגלו ככלים שימושיים במבחנה בחקר אטיולוגיה של סרטן, פתולוגיה והיענות לתרופות¹. באופן מסורתי, ספרואידים גודלו בתרבית בתנאים כגון לוחות הדבקה נמוכים או ביוריאקטורים, שבהם היצמדות התא מועדפת על פני היצמדות פני התא². עם זאת, כיום ידוע כי כדי לשחזר את המיקרו-סביבה של הגידול בצורה נאמנה יותר, מודלים ספרואידים במבחנה צריכים ללכוד הן אינטראקציות תא-תא והן אינטראקציות מטריצת תאים. זה גרם לקבוצות רבות לתכנן פיגומים, כגון הידרוג'לים, שבהם ניתן לעטוף ספרואידים ^3,4. מודלים ספרואידים מבוססי הידרוג'ל כאלה מאפשרים הבהרה של אינטראקציות תא-תא ומ....

Protocol

1. הכנת פתרונות

1. הכנת תמיסת קודמן של פולידימתילסילוקסאן (PDMS)
   1. הכן את הפתרון המבשר PDMS שלילי (המשמש גם עבור תמיסת מבשר דבק). הכניסו את האלסטומר לסירת שקילה בעזרת מרית ושקלו אותו. הוסף את חומר הריפוי לבסיס האלסטומר ביחס של 1:10. ערבבו את ה-PDMS ואת חומר הריפוי בעדינות וביסודיות בעזר?.......

Discussion

מודלים ספרואידים רב-תאיים מבוססי הידרוג'ל מפותחים יותר ויותר כדי לקדם תגליות טיפוליות בסרטן 11,13,29. הם מועילים מכיוון שהם מחקים פרמטרים מרכזיים של מיקרו-סביבת הגידול באופן מבוקר, ולמרות מורכבותם, הם פשוטים וזולים יותר לשימוש מאשר מודלים in .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
70% Ethanol	Fisher Scientific	LC22210-4
15 mL Conicals	FALCON	352097
24-Well Plate Ultra Low Attachment plates	Fisher Scientific	07-200-602
35 mm Petri Dish	Amazon	706011
4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa)	Laysan Bio	ACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL Conicals	Fisher Scinetific	3181345107
6-well AggreWell 400	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	34421	Square pyramidal microwells
anti-adherence rinsing solution	StemCell Technologies, Vancouver, Canada	Cat #: 07010
Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Chemical Fume Hood	KEWAUNEE	99151
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free	Corning	356234	Basement membrane matrix
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Thermo Scientific	62247
Detergent - Triton-X	Sigma Aldrich	T8787	Nonionic surfactant
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100
Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Fisher Scinetific	1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F
Fetal Bovine Serum	HyClone	SH30073-03
Formaldehyde 37% Solution	Sigma Aldrich	F1635
Glass Plates	Slumpys	GBS4100SFSL
Glass Transfer Pipettes	Fisher Scinetific	5 3/4": 1367820A, 9":136786B
Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide	Genic Bio, Shanghai, China	n/a	Custom synthesis
Hemacytometer	Bright-Line	383684
Hydrophobic solution - Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
Incubator	NUAIRE	NU-8500
Inverted Microscope (Axiovert 25)	Zeiss	663526
Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)	Fisher Scientific	D1125
Leica Confocal SP8	Leica Microsystems Inc.
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)	Zeiss	3820005619
Micro centrifuge tubes	Fisher Scientific	2 mL: 02681258
Microscope Software	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927
Parafilm	PARAFILM	PM992
PBS (1x), pH 7.4	HyClone	SH30256.01
Penicillin Streptomycin	MP Biomedicals	1670046
Pipette Aid	Drummond Scientific Co.	P-76864
Pipette Tips (1–200 µL, 101–1000 µL)	Fisher Scinetific	2707509
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes	Fisher Scientific	13-711-9D
Plastic Weigh Boats (100 mL)	Amazon	mdo-azoc-1030
poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)	Laysan Bio	SH-PEG-SH-3400-5g
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]	Elsworth Adhesives	3097358-1004	Polydimethylsiloxane
Powder Free Examination Gloves	Quest	92897
Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln.	Fisher Scientific	AAJ66584AB
RPMI-1640 Medium (1x)	HyClone	SH30027-02
Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	sc-365823
Tissue Culture Hood	NUAIRE	NU-425-600
Triethanolamine, ≥99.0% (GC)	Sigma Aldrich	90279
Trypsin 0.25% (1x)	Sigma Aldrich	SH30042.01
U-87 MG human glioblastoma cells	American Type Culture Collection	HTB-14