Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Neuroscience
تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون لنشاط الدماغ الأمامي في تصرف الزرد البالغ
هنا ، نقدم بروتوكولا لإجراء تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون في الدماغ الأمامي الظهري لسمك الزرد البالغ.
يظهر الزرد البالغ (Danio rerio) ذخيرة غنية من السلوكيات لدراسة الوظائف المعرفية. لديهم أيضا دماغ مصغر يمكن استخدامه لقياس الأنشطة عبر مناطق الدماغ من خلال طرق التصوير البصري. ومع ذلك ، كانت التقارير حول تسجيل نشاط الدماغ في سلوك الزرد البالغ نادرة. تصف الدراسة الحالية إجراءات إجراء تصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون في الدماغ الأمامي الظهري لسمك الزرد البالغ. نحن نركز على خطوات لمنع أسماك الزرد البالغة من تحريك رؤوسها ، مما يوفر الاستقرار الذي يتيح التصوير بالليزر لنشاط الدماغ. يمكن للحيوانات المقيدة الرأس تحريك أجزاء أجسامها بحرية والتنفس دون مساعدات. يهدف الإجراء إلى تقصير وقت جراحة تقييد الرأس ، وتقليل حركة الدماغ ، وزيادة عدد الخلايا العصبية المسجلة. يتم أيضا وصف الإعداد لتقديم بيئة بصرية غامرة أثناء تصوير الكالسيوم هنا ، والذي يمكن استخدامه لدراسة الارتباطات العصبية الكامنة وراء السلوكيات المحفزة بصريا.
كان التصوير الفلوري للكالسيوم باستخدام مؤشرات مشفرة وراثيا أو أصباغ اصطناعية طريقة قوية لقياس النشاط العصبي في الحيوانات التي تتصرف ، بما في ذلك الرئيسيات غير البشرية والقوارض والطيور والحشرات1. يمكن قياس نشاط مئات الخلايا ، حتى حوالي 800 ميكرومتر تحت سطح الدماغ ، في وقت واحد باستخدام التصوير متعدد الفوتون 2,3. يمكن أيضا قياس نشاط أنواع معينة من الخلايا عن طريق التعبير عن مؤشرات الكالسيوم في مجموعات الخلايا العصبية المحددة وراثيا. يفتح تطبيق طريقة التصوير لنماذج الفقاريات الصغيرة إمكانيات جديدة في مجال حساب الخلايا العصبية عبر مناطق الدماغ.
الزرد هو نظام نموذ....
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في Academia Sinica. يمكن العثور على تفاصيل أدوات البحث في جدول المواد.
1. إعداد غرفة التسجيل
- قم بإعداد خزان شبه سداسي ، ولوحة قاعدة ، ومرحلة رأ?.......
يتكون البروتوكول من جزأين: جراحة تقييد الرأس وتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون للأنشطة العصبية في الدماغ الأمامي. يتم تعريف نجاح الجراحة من خلال بقاء الحيوان واستقرار مسند الرأس. يمكن تحسين معدل البقاء على قيد الحياة بشكل كبير عن طريق التروية المتكررة لمحلول TMS بنسبة 0.01٪ عن طريق الفم أثناء ا.......
هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لتقييد رأس الزرد البالغ لتصوير الكالسيوم ثنائي الفوتون. هناك خطوتان حاسمتان لتحقيق مسند رأس مستقر بدرجة كافية للتصوير بالمسح الضوئي بالليزر. أولا ، يجب لصق شريط الرأس على مواقع التعلق المحددة للجماجم. غالبا ما تكون الأجزاء الأخرى من الجمجمة رقيقة جدا بحيث لا توف?.......
تم دعم هذا العمل من قبل معهد البيولوجيا الجزيئية ، Academia Sinica ، والمجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا ، تايوان. ساعد متجر الآلات في معهد الفيزياء ، أكاديميا سينيكا في تصنيع أجزاء مصممة خصيصا. نود أيضا أن نشكر P. Argast (معهد فريدريش ميشر للبحوث الطبية الحيوية ، بازل ، سويسرا) على تصميم آلية القفل السريع لمرحلة الرأس.
....| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acquisition card | MBF Bioscience | Vidrio vDAQ | Microscope |
| Back-projection film | Kimoto | Diland screen - GSK | present visual stimulus |
| Band-pass filter (510/80 nm) | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Base plate for the semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Camera filter (<875 nm) | Edmund optics | #86-106 | Behavior recording |
| Camera filter (>700 nm) | Edmund optics | #43-949 | Behavior recording |
| Camera lens | Thorlabs | MVL50M23 | Behavior recording |
| Chameleon Vision-S | Coherent | Vision-S | Laser |
| Circular plate for the head stage | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Controller for piezo actuator | Physik Instrumente | E-665. CR | Microscope |
| Current amplifier | Thorlabs | TIA60 | Microscope |
| Elitedent Q-6 | Rolence Enterprise | Q-6 | Surgery: UV lamp |
| Emission Filter 510/80 nm | Chroma | ET510/80m | Microscope |
| Head bar | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Infrared light | Thorlabs | M810L3 | Behavior recording |
| LED projector | AAXA | P2B LED Pico Projector | present visual stimulus |
| Moist paper tissue (Kimwipe) | Kimtech Science | 34155 | Surgery: moist paper tissue |
| Motorized XY sample stage | Zaber | X-LRM050 | Microscope |
| Neutral Density Filters (50% Transmission) | Thorlabs | NE203B | present visual stimulus |
| Ø1/2" Post Holder | ThorLabs | PH1.5V | Surgery: hollow tube for cannon |
| Ø1/2" Stainless Steel Optical Post | ThorLabs | TR150/M | Surgery: fish loading module |
| Objective lens 16x, 0.8NA | Nikon | CF175 | Microscope |
| Oil-based modeling clay | Ly Hsin Clay | C4086 | Surgery: head bar holder |
| Optical adhesive | Norland Products | NOA68 | Surgery: UV curable glue |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | H11706P-40 | Microscope |
| Piezo actuator | Physik Instrumente | P-725.4CA PIFOC | Microscope |
| Pockels Cell | Conoptics | M350-80-LA-BK-02 | Microscope |
| Red Wratten filter (> 600 nm) | Edmund optics | #53-699 | present visual stimulus |
| Resonant-Galvo Scan System | INSS | RGE-02 | Microscope |
| Right-Angle Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | RA90/M | Surgery: fish loading module |
| Rotating Clamp for Ø1/2" Post | ThorLabs | SWC/M | Surgery: fish loading module |
| ScanImage | MBF Bioscience | Basic version | Microscope |
| Semi-hexagonal tank | custom made | see supplemental files | recording chamber |
| Super-Bond C&B Kit | Sun Medical Co. | Super-Bond C&B | Surgery: dental cement |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Surgery: anesthetic |
| USB Camera | FLIR | BFS-U3-13Y3M-C | Behavior recording |
| Vetbond | 3M | 1469SB | Surgery: tissue glue |
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Chow, D. M., et al. Deep three-photon imaging of the brain in intact adult zebrafish. Nature Methods. 17 (6), 605-608 (2020).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Friedrich, R. W., Jacobson, G. A., Zhu, P. Circuit neuroscience in zebrafish. Current Biology. 20 (8), R371-R381 (2010).
- Kappel, J. M., et al. Visual recognition of social signals by a tectothalamic neural circuit. Nature. 608 (7921), 146-152 (2022).
- Bartoszek, E. M., et al. Ongoing habenular activity is driven by forebrain networks and modulated by olfactory stimuli. Current Biology. 31 (17), 3861-3874 (2021).
- Valente, A., Huang, K. H., Portugues, R., Engert, F. Ontogeny of classical and operant learning behaviors in zebrafish. Learning & Memory. 19 (4), 170-177 (2012).
- Buske, C., Gerlai, R. Maturation of shoaling behavior is accompanied by changes in the dopaminergic and serotoninergic systems in zebrafish. Developmental Psychobiology. 54 (1), 28-35 (2012).
- Huang, K. H., et al. A virtual reality system to analyze neural activity and behavior in adult zebrafish. Nature Methods. 17 (3), 343-351 (2020).
- Rupprecht, P., Prendergast, A., Wyart, C., Friedrich, R. W. Remote z-scanning with a macroscopic voice coil motor for fast 3D multiphoton laser scanning microscopy. Biomedical Optics Express. 7 (5), 1656-1671 (2016).
- Papadopoulos, I. N., Jouhanneau, J. -. S., Poulet, J. F. A., Judkewitz, B. Scattering compensation by focus scanning holographic aberration probing (F-SHARP). Nature Photonics. 11 (2), 116-123 (2017).
- Torigoe, M., et al. Zebrafish capable of generating future state prediction error show improved active avoidance behavior in virtual reality. Nature Communications. 12 (1), 5712 (2021).
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved