成年斑马鱼前脑活动的双光子钙成像

在这里，我们提出了一种在成年斑马鱼的背前脑中进行双光子钙成像的方案。

成年斑马鱼（Danio rerio）表现出丰富的行为，用于研究认知功能。它们还有一个微型大脑，可用于通过光学成像方法测量跨大脑区域的活动。然而，关于记录成年斑马鱼大脑活动的报道很少。本研究描述了在成年斑马鱼背侧前脑进行双光子钙成像的程序。我们专注于限制成年斑马鱼移动头部的步骤，这提供了稳定性，可以对大脑活动进行激光扫描成像。头部束缚的动物可以在没有辅助工具的情况下自由移动身体部位和呼吸。该手术旨在缩短头部约束手术的时间，最大限度地减少大脑运动，并最大限度地增加记录的神经元数量。本文还描述了在钙成像过程中呈现沉浸式视觉环境的设置，可用于研究潜在的视觉触发行为的神经相关性。

使用基因编码指示剂或合成染料的钙荧光成像一直是测量行为动物（包括非人灵长类动物、啮齿动物、鸟类和昆虫）神经元活动的有效方法¹。使用多光^{子成像可以}同时测量数百个细胞的活动，这些细胞在脑表面以下约800μm处^2,3。特定细胞类型的活性也可以通过在遗传定义的神经元群中表达钙指示剂来测量。成像方法在小型脊椎动物模型中的应用为跨大脑区域的神经元计算领域开辟了新的可能性。

斑马鱼是神经科学研究中广泛使用的模型系统。受精后 6 天左右的斑马鱼幼虫由于其微型大脑和透明的身体而被用于钙成像⁴.幼年斑马鱼（3-4周龄）也用于研究感觉运动通路的神经机制^5,6。然而，复杂行为（包括联想学习和社会行为）的最大表现水平是在年龄^{较大的 7,8} 岁时达到的。因此，需要一个可靠的方案来使用成像方法研究成年斑马鱼大脑中的多种认知功能。虽然斑马鱼幼虫和幼年斑马鱼可以嵌入琼脂糖中进行活体成像，但 2 个月或以上的成年斑马鱼在这种情况下会缺氧，并且身体太强壮....

所有动物程序均按照中央研究院动物护理和使用机构委员会的指导方针批准和执行。研究工具的详细信息可以在 材料表中找到。

1、录音室的准备

1. 准备一个半六角形罐、一个底板和一个头部阶段（图1A;补充文件1-3）。头部平台由连接到圆形板上的两个金属柱组成。圆形板包含可以锁定在底板上的凹槽。锁定?.......

该协议由两部分组成：头部约束手术和前脑神经元活动的双光子钙成像。手术的成功取决于动物的存活率和头枕的稳定性。手术时经口频繁灌注0.01%TMS溶液可大大提高存活率。鱼应从麻醉中恢复，并在浸入鱼缸水后1-2分钟内积极呼吸。双光子钙成像能够通过完整的颅骨（~40 μm）在距脑表面200μm深度的背侧前脑中记录单个神经元的活动。该成像范围覆盖端脑背侧 （D） 的多个区域，包括内侧区 （Dm?.......

在这里，我们描述了一种详细的方案，以限制成年斑马鱼的头部进行双光子钙成像。要实现足够稳定的头枕，有两个关键步骤可以进行激光扫描成像。首先，头杆必须粘在头骨的特定附着部位。颅骨的其他部位通常太薄，无法提供机械稳定性，甚至可能在剧烈的身体运动中骨折。其次，必须彻底去除附着部位上方的皮肤。残留的水也应彻底干燥。这使得头骨能够与组织胶紧密结合。提供了一个表?.......

这项工作得到了中央研究院分子生物学研究所和台湾国家科学技术委员会的支持。中央研究院物理研究所的机械车间帮助制造定制设计的零件。我们还要感谢 P. Argast（瑞士巴塞尔弗里德里希·米歇尔生物医学研究所）设计了头部载物台的快速锁定机制。