To-foton calciumbilleddannelse af forhjerneaktivitet i opførende voksne zebrafisk

Her præsenterer vi en protokol til at udføre to-foton calciumbilleddannelse i den dorsale forhjerne hos voksne zebrafisk.

Voksne zebrafisk (Danio rerio) udviser et rigt repertoire af adfærd til at studere kognitive funktioner. De har også en miniaturehjerne, der kan bruges til at måle aktiviteter på tværs af hjerneområder gennem optiske billeddannelsesmetoder. Imidlertid har rapporter om registrering af hjerneaktivitet i opførende voksne zebrafisk været sparsomme. Denne undersøgelse beskriver procedurer til udførelse af to-foton calciumbilleddannelse i den dorsale forhjerne hos voksne zebrafisk. Vi fokuserer på trin til at forhindre voksne zebrafisk i at bevæge hovedet, hvilket giver stabilitet, der muliggør laserscanningsbilleddannelse af hjerneaktiviteten. De hovedfastholdte dyr kan frit bevæge deres kropsdele og trække vejret uden hjælpemidler. Proceduren sigter mod at forkorte tiden for nakkestøttekirurgi, minimere hjernens bevægelse og maksimere antallet af registrerede neuroner. En opsætning til præsentation af et fordybende visuelt miljø under calciumbilleddannelse er også beskrevet her, som kan bruges til at studere neurale korrelater underliggende visuelt udløst adfærd.

Calciumfluorescensbilleddannelse med genetisk kodede indikatorer eller syntetiske farvestoffer har været en kraftfuld metode til måling af neuronal aktivitet i dyr, herunder ikke-menneskelige primater, gnavere, fugle og insekter¹. Aktiviteten af hundredvis af celler, op til ca. 800 μm under hjerneoverfladen, kan måles samtidigt ved hjælp af multifotonbilleddannelse ^2,3. Aktiviteten af specifikke celletyper kan også måles ved at udtrykke calciumindikatorer i genetisk definerede neuronale populationer. Anvendelse af billeddannelsesmetoden til små hvirveldyrmodeller åbner nye muligheder in....

Alle dyreforsøg blev godkendt og udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee of Academia Sinica. Detaljer om forskningsværktøjerne findes i materialefortegnelsen.

1. Klargøring af optagekammer

1. Forbered en halvsekskantet tank, en bundplade og et hovedtrin (figur 1A; Supplerende filer 1-3). Hovedscenen består af to metalstolper fastgjort til en cirku.......

Protokollen består af to dele: nakkestøttekirurgi og to-foton calciumbilleddannelse af neuronale aktiviteter i forhjernen. Operationens succes er defineret af dyrets overlevelse og nakkestøttens stabilitet. Overlevelsesraten kan forbedres betydeligt ved hyppig perfusion af 0,01% TMS-opløsning gennem munden under operationen. Fisk skal komme sig efter anæstesi og trække vejret aktivt inden for 1-2 minutter efter at være nedsænket i akvariumvand. To-foton calciumbilleddannelse muliggør aktivitetsregistrering af in.......

Her beskriver vi en detaljeret protokol til at fastholde hovedet af voksne zebrafisk til to-foton calciumbilleddannelse. Der er to kritiske trin for at opnå en nakkestøtte, der er stabil nok til laserscanningsbilleddannelse. Først skal hovedstangen limes på kraniernes specifikke fastgørelsessteder. Andre dele af kraniet er ofte for tynde til at give mekanisk stabilitet og kan endda blive brudt under stærke kropsbevægelser. For det andet skal huden over fastgørelsesstederne fjernes grundigt. Resterende vand skal o.......

Dette arbejde blev støttet af Institute of Molecular Biology, Academia Sinica og National Science and Technology Council, Taiwan. Maskinværkstedet ved Institut for Fysik, Academia Sinica hjalp med at fremstille specialdesignede dele. Vi vil også gerne takke P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel, Schweiz) for designet af hurtiglåsemekanismen på hovedscenen.