Calciumbeeldvorming met twee fotonen van de activiteit van de voorhersenen bij zich gedragende volwassen zebravissen

Hier presenteren we een protocol om twee-foton calciumbeeldvorming uit te voeren in de dorsale voorhersenen van volwassen zebravissen.

Volwassen zebravissen (Danio rerio) vertonen een rijk repertoire aan gedragingen voor het bestuderen van cognitieve functies. Ze hebben ook een miniatuurbrein dat kan worden gebruikt voor het meten van activiteiten in hersengebieden door middel van optische beeldvormingsmethoden. Rapporten over de registratie van hersenactiviteit bij zich gedragende volwassen zebravissen zijn echter schaars. De huidige studie beschrijft procedures om twee-foton calciumbeeldvorming uit te voeren in de dorsale voorhersenen van volwassen zebravissen. We richten ons op stappen om te voorkomen dat volwassen zebravissen hun kop bewegen, wat zorgt voor stabiliteit die laserscanning van de hersenactiviteit mogelijk maakt. De dieren met hun hoofd kunnen hun lichaamsdelen vrij bewegen en ademen zonder hulpmiddelen. De procedure heeft tot doel de tijd van een hoofdsteunoperatie te verkorten, de hersenbeweging te minimaliseren en het aantal geregistreerde neuronen te maximaliseren. Hier wordt ook een opstelling beschreven voor het presenteren van een meeslepende visuele omgeving tijdens calciumbeeldvorming, die kan worden gebruikt om neurale correlaten te bestuderen die ten grondslag liggen aan visueel getriggerd gedrag.

Calciumfluorescentiebeeldvorming met genetisch gecodeerde indicatoren of synthetische kleurstoffen is een krachtige methode geweest om neuronale activiteit te meten bij zich gedragende dieren, waaronder niet-menselijke primaten, knaagdieren, vogels en^insecten. De activiteit van honderden cellen, tot ongeveer 800 μm onder het hersenoppervlak, kan tegelijkertijd worden gemeten met behulp van multi-fotonbeeldvorming ^2,3. De activiteit van specifieke celtypen kan ook worden gemeten door calciumindicatoren tot expressie te brengen in genetisch gedefinieerde neuronale populaties. Toepassing v....

Alle dierproeven zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van Academia Sinica. Details van de onderzoeksinstrumenten zijn te vinden in de Materiaaltabel.

1. Voorbereiding van de opnamekamer

1. Bereid een semi-zeshoekige tank, een grondplaat en een hoofdtrap voor (Figuur 1A; Aanvullende bestanden 1-3). Het hoofdpodium bestaat uit .......

Het protocol bestaat uit twee delen: een hoofdsteunoperatie en twee-foton calciumbeeldvorming van neuronale activiteiten in de voorhersenen. Het succes van een operatie wordt bepaald door de overleving van het dier en de stabiliteit van de hoofdsteun. Het overlevingspercentage kan sterk worden verbeterd door frequente perfusie van 0,01% TMS-oplossing via de mond tijdens de operatie. Vissen moeten herstellen van de anesthesie en actief ademen binnen 1-2 minuten nadat ze in aquariumwater zijn ondergedompeld. Calciumbeeldvo.......

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om de kop van volwassen zebravissen in bedwang te houden voor calciumbeeldvorming met twee fotonen. Er zijn twee cruciale stappen om een hoofdsteun te krijgen die stabiel genoeg is voor laserscanning. Eerst moet de hoofdbalk op de specifieke bevestigingsplaatsen van de schedels worden gelijmd. Andere delen van de schedel zijn vaak te dun om mechanische stabiliteit te bieden en kunnen zelfs worden gebroken tijdens sterke lichaamsbewegingen. Ten tweede moet de huid boven de aa.......

Dit werk werd ondersteund door het Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, en de National Science and Technology Council, Taiwan. De machinewerkplaats van het Institute of Physics, Academia Sinica, hielp bij het vervaardigen van op maat ontworpen onderdelen. We willen ook P. Argast (Friedrich Miescher Instituut voor Biomedisch Onderzoek, Basel, Zwitserland) bedanken voor het ontwerp van het snelsluitmechanisme van de hoofdstage.