Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung der Vorderhirnaktivität bei sich verhaltenden erwachsenen Zebrafischen

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Durchführung von Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung im dorsalen Vorderhirn von erwachsenen Zebrafischen vor.

Ausgewachsene Zebrafische (Danio rerio) weisen ein reiches Repertoire an Verhaltensweisen zur Untersuchung kognitiver Funktionen auf. Sie verfügen auch über ein Miniaturgehirn, mit dem Aktivitäten in verschiedenen Hirnregionen durch optische Bildgebungsverfahren gemessen werden können. Es gibt jedoch nur wenige Berichte über die Aufzeichnung der Gehirnaktivität bei sich verhaltenden erwachsenen Zebrafischen. Die vorliegende Studie beschreibt Verfahren zur Durchführung von Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung im dorsalen Vorderhirn von adulten Zebrafischen. Wir konzentrieren uns auf Schritte, um erwachsene Zebrafische daran zu hindern, ihren Kopf zu bewegen, was eine Stabilität bietet, die eine Laserscanning-Bildgebung der Gehirnaktivität ermöglicht. Die kopfgefesselten Tiere können ihre Körperteile frei bewegen und ohne Hilfsmittel atmen. Das Verfahren zielt darauf ab, die Zeit der Kopfstützenoperation zu verkürzen, die Gehirnbewegung zu minimieren und die Anzahl der aufgezeichneten Neuronen zu maximieren. Hier wird auch ein Aufbau zur Darstellung einer immersiven visuellen Umgebung während der Kalziumbildgebung beschrieben, der verwendet werden kann, um neuronale Korrelate zu untersuchen, die visuell ausgelösten Verhaltensweisen zugrunde liegen.

Die Kalziumfluoreszenz-Bildgebung mit genetisch kodierten Indikatoren oder synthetischen Farbstoffen ist eine leistungsstarke Methode zur Messung der neuronalen Aktivität bei sich verhaltenden Tieren, einschließlich nichtmenschlicher Primaten, Nagetiere, Vögel und Insekten¹. Die Aktivität von Hunderten von Zellen, bis zu etwa 800 μm unter der Gehirnoberfläche, kann gleichzeitig mit Hilfe der Multi-Photonen-Bildgebung gemessen^{werden 2,3}. Die Aktivität bestimmter Zelltypen kann auch durch die Expression von Kalziumindikatoren in genetisch definierten neuronalen Populationen gemessen werde....

Alle Tierbehandlungen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Academia Sinica genehmigt und durchgeführt. Details zu den Forschungsinstrumenten finden Sie in der Materialtabelle.

1. Vorbereitung der Aufnahmekammer

1. Bereiten Sie einen halbsechseckigen Tank, eine Grundplatte und eine Kopfstufe vor (Abbildung 1A; Ergänzungsakten 1-3). Die Kopfstufe.......

Das Protokoll besteht aus zwei Teilen: der Kopfstützenchirurgie und der Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung neuronaler Aktivitäten im Vorderhirn. Der Erfolg einer Operation wird durch das Überleben des Tieres und die Stabilität der Kopfstütze bestimmt. Die Überlebensrate kann durch häufige Perfusion von 0,01%iger TMS-Lösung durch den Mund während der Operation stark verbessert werden. Die Fische sollten sich von der Narkose erholen und innerhalb von 1-2 Minuten aktiv atmen, nachdem sie in das Wasser des Aquariums e.......

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Fixierung des Kopfes von erwachsenen Zebrafischen für die Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung. Es gibt zwei entscheidende Schritte, um eine Kopfstütze zu erreichen, die stabil genug für die Laserscanning-Bildgebung ist. Zuerst muss der Kopfbügel auf die spezifischen Befestigungsstellen der Schädel geklebt werden. Andere Teile des Schädels sind oft zu dünn, um mechanische Stabilität zu gewährleisten, und können bei starken Körperbewegungen sogar gebrochen werden.......

Diese Arbeit wurde vom Institut für Molekularbiologie, Academia Sinica, und dem National Science and Technology Council, Taiwan, unterstützt. Die Maschinenwerkstatt des Instituts für Physik der Academia Sinica half bei der Herstellung von kundenspezifischen Teilen. Wir danken auch P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel, Schweiz) für die Konstruktion des Schnellverschlussmechanismus der Kopfstufe.