To-foton kalsiumavbildning av forhjerneaktivitet i oppførsel av voksen sebrafisk

Her presenterer vi en protokoll for å utføre to-foton kalsiumavbildning i dorsalforhjernen til voksen sebrafisk.

Voksen sebrafisk (Danio rerio) utviser et rikt repertoar av atferd for å studere kognitive funksjoner. De har også en miniatyrhjerne som kan brukes til å måle aktiviteter på tvers av hjernegrupper gjennom optiske bildebehandlingsmetoder. Rapporter om registrering av hjerneaktivitet hos voksne sebrafisk som oppfører seg har imidlertid vært mangelvare. Denne studien beskriver prosedyrer for å utføre to-foton kalsiumavbildning i den dorsale forhjernen til voksen sebrafisk. Vi fokuserer på tiltak for å hindre voksne sebrafisk i å bevege hodet, noe som gir stabilitet som muliggjør laserskanning av hjerneaktiviteten. De hodebeherskede dyrene kan fritt bevege kroppsdelene sine og puste uten hjelpemidler. Prosedyren tar sikte på å forkorte tiden for hodestøtteoperasjon, minimere hjernens bevegelse og maksimere antall registrerte nevroner. Et oppsett for å presentere et oppslukende visuelt miljø under kalsiumavbildning er også beskrevet her, som kan brukes til å studere nevrale korrelater underliggende visuelt utløst atferd.

Kalsiumfluorescensavbildning med genetisk kodede indikatorer eller syntetiske fargestoffer har vært en kraftig metode for å måle nevronaktivitet hos dyr som oppfører seg, inkludert ikke-menneskelige primater, gnagere, fugler og insekter¹. Aktiviteten til hundrevis av celler, opptil ca. 800 μm under hjerneoverflaten, kan måles samtidig ved hjelp av multifotonavbildning ^2,3. Aktiviteten til spesifikke celletyper kan også måles ved å uttrykke kalsiumindikatorer i genetisk definerte nevronpopulasjoner. Anvendelse av avbildningsmetoden for små virveldyrmodeller åpner for nye muligheter innen....

Alle dyreprosedyrer ble godkjent og utført i samsvar med retningslinjene fra Institutional Animal Care and Use Committee of Academia Sinica. Detaljer om forskningsverktøyene finner du i materialfortegnelsen.

1. Klargjøring av opptakskammer

1. Forbered en semi-sekskantet tank, en bunnplate og et hodetrinn (figur 1A; Tilleggsfiler 1-3). Hodetrinnet består av to metallstolper festet til en sirkulær plate........

Protokollen består av to deler: hodestøttekirurgi og to-foton kalsiumavbildning av nevronaktiviteter i forhjernen. Suksessen til kirurgi er definert av dyrets overlevelse og stabiliteten til hodestøtten. Overlevelsesraten kan forbedres sterkt ved hyppig perfusjon av 0,01% TMS-løsning gjennom munnen under operasjonen. Fisk skal komme seg fra anestesi og puste aktivt innen 1-2 min etter å ha blitt nedsenket i fisketankvann. To-foton kalsiumavbildning muliggjør aktivitetsregistrering av individuelle nevroner i den dor.......

Her beskriver vi en detaljert protokoll for å begrense hodet til voksen sebrafisk for to-foton kalsiumavbildning. Det er to kritiske trinn for å oppnå en hodestøtte som er stabil nok til laserskanning. Først må hodestangen limes til de spesifikke festestedene til hodeskallene. Andre deler av skallen er ofte for tynne til å gi mekanisk stabilitet og kan til og med bli brukket under sterke kroppsbevegelser. For det andre må huden over festestedene fjernes grundig. Restvann bør også tørkes grundig. Dette gjør at.......

Dette arbeidet ble støttet av Institute of Molecular Biology, Academia Sinica og National Science and Technology Council, Taiwan. Maskinverkstedet ved Institutt for fysikk, Academia Sinica, hjalp til med å produsere spesialdesignede deler. Vi vil også takke P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel, Sveits) for utformingen av hurtiglåsmekanismen til hovedtrinnet.