Tvåfotonkalciumavbildning av framhjärnans aktivitet hos vuxna zebrafiskar som beter sig

Här presenterar vi ett protokoll för att utföra tvåfotonkalciumavbildning i den dorsala framhjärnan hos vuxna zebrafiskar.

Vuxna zebrafiskar (Danio rerio) uppvisar en rik repertoar av beteenden för att studera kognitiva funktioner. De har också en miniatyrhjärna som kan användas för att mäta aktiviteter i olika hjärnregioner genom optiska avbildningsmetoder. Rapporter om registrering av hjärnaktivitet hos vuxna zebrafiskar har dock varit knapphändiga. Den aktuella studien beskriver procedurer för att utföra tvåfotonkalciumavbildning i den dorsala framhjärnan hos vuxna zebrafiskar. Vi fokuserar på åtgärder för att hindra vuxna zebrafiskar från att röra på huvudet, vilket ger stabilitet som möjliggör laserskanning av hjärnaktiviteten. De fastspända djuren kan röra sina kroppsdelar fritt och andas utan hjälpmedel. Proceduren syftar till att förkorta tiden för huvudstödsoperation, minimera hjärnans rörelser och maximera antalet neuroner som registreras. Här beskrivs också ett upplägg för att presentera en uppslukande visuell miljö under kalciumavbildning, som kan användas för att studera neurala korrelat som ligger till grund för visuellt utlösta beteenden.

Kalciumfluorescensavbildning med genetiskt kodade indikatorer eller syntetiska färgämnen har varit en kraftfull metod för att mäta neuronal aktivitet hos djur som beter sig, inklusive icke-mänskliga primater, gnagare, fåglar och insekter¹. Aktiviteten hos hundratals celler, upp till cirka 800 μm under hjärnans yta, kan mätas samtidigt med hjälp av multifotonavbildning ^2,3. Aktiviteten hos specifika celltyper kan också mätas genom att uttrycka kalciumindikatorer i genetiskt definierade neuronala populationer. Tillämpning av avbildningsmetoden för modeller av små ryggradsdjur öppnar nya m....

Alla djurförsök godkändes och utfördes i enlighet med riktlinjerna från Institutional Animal Care and Use Committee of Academia Sinica. Detaljer om forskningsverktygen finns i materialförteckningen.

1. Förberedelse av inspelningskammaren

1. Förbered en halvsexkantig tank, en bottenplatta och ett huvudsteg (Figur 1A; Kompletterande filer 1-3). Huvudsteget består av två metallstolpar som är fästa .......

Protokollet består av två delar: huvudstödskirurgi och tvåfotonkalciumavbildning av neuronala aktiviteter i framhjärnan. Operationens framgång definieras av djurets överlevnad och nackstödets stabilitet. Överlevnadsgraden kan förbättras avsevärt genom frekvent perfusion av 0,01 % TMS-lösning genom munnen under operationen. Fiskar bör återhämta sig från bedövning och andas aktivt inom 1-2 minuter efter att ha sänkts ner i akvarievatten. Kalciumavbildning med två foton möjliggör aktivitetsregistrering.......

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att hålla fast huvudet på vuxna zebrafiskar för kalciumavbildning med två fotoner. Det finns två viktiga steg för att uppnå ett nackstöd som är tillräckligt stabilt för laserskanning. Först måste huvudstången limmas fast på skallarnas specifika fästställen. Andra delar av skallen är ofta för tunna för att ge mekanisk stabilitet och kan till och med få frakturer vid starka kroppsrörelser. För det andra måste huden ovanför fästställena tas bort nogg.......

Detta arbete stöddes av Institute of Molecular Biology, Academia Sinica och National Science and Technology Council, Taiwan. Maskinverkstaden vid Institute of Physics, Academia Sinica hjälpte till att tillverka specialdesignade delar. Vi vill också tacka P. Argast (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel, Schweiz) för utformningen av huvudstegets snabblåsmekanism.