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Este artigo apresenta um protocolo para diferenciação dirigida e análise funcional de células semelhantes a células β. Descrevemos as condições e passagens ideais de cultura para células-tronco pluripotentes humanas antes de gerar células pancreáticas produtoras de insulina. A diferenciação em seis estágios progride desde a formação definitiva da endoderme até células funcionais semelhantes às células β que secretam insulina em resposta à glicose.
As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) podem se diferenciar em qualquer tipo de célula, tornando-as uma excelente fonte alternativa de células-β pancreáticas humanas. As hPSCs podem ser células-tronco embrionárias (hESCs) derivadas do blastocisto ou células pluripotentes induzidas (hiPSCs) geradas diretamente de células somáticas usando um processo de reprogramação. Aqui um protocolo baseado em vídeo é apresentado para delinear as condições ideais de cultura e passagem para hPSCs, antes de sua diferenciação e subsequente geração de células pancreáticas produtoras de insulina. Essa metodologia segue o processo de seis estágios para diferenciação dirigida a células β, em que as hPSCs se diferenciam em endoderme (DE) definitiva, tubo intestinal primitivo, destino do intestino anterior, progenitores pancreáticos, progenitores endócrinos pancreáticos e, finalmente, células β pancreáticas. Vale ressaltar que essa metodologia de diferenciação leva um período de 27 dias para gerar as células-β pancreáticas humanas. O potencial de secreção de insulina foi avaliado através de dois experimentos, que incluíram imunomarcação e secreção de insulina estimulada por glicose.
As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) têm a capacidade única de se diferenciar em vários tipos celulares, tornando-as uma alternativa viável às células-β pancreáticas humanas1. Essas hPSCs são categorizadas em dois tipos: células-tronco embrionárias (hESCs), derivadas do blastocisto2, e células pluripotentes induzidas (hiPSCs), geradas pela reprogramação direta de célulassomáticas3. O desenvolvimento de técnicas para diferenciar hPSCs em células-β tem implicações importantes tanto para a pesquisa fundamental quanto para a prática clínica 1,4
Antes de iniciar a diferenciação, recomenda-se determinar o número necessário de organoides semelhantes a ilhotas para fins experimentais. Em uma placa de 6 poços, um único poço com mais de 80% de confluência normalmente consiste de 2-2,3 milhões de hPSCs. Enquanto uma previsão precisa é desafiadora devido a variações nas linhas de hPSC e eficiência de diferenciação, uma estimativa aproximada é 1,5 vezes o número de poços iniciais. Uma diferenciação efetivamente dirigida geralmente produz 1,6 a 2 mil.......
O protocolo descrito neste trabalho oferece uma abordagem altamente eficiente para diferenciar células β do tipohPSCs 10. Esse processo utiliza um sistema de cultura 2D que é facilmente escalável, possibilitando seu uso em diversos cenários experimentais, como diferenciação de aprendizagem, projetos e laboratórios menores e testes-piloto para avaliar o potencial de diferenciação de uma linha iPSC.
É essencial caracterizar as propriedades funcionais de célula.......
O sucesso da diferenciação das hPSCs em células β pancreáticas depende da otimização de todos os aspectos da cultura de rotina e da passagem das hPSCs selecionadas. Isso inclui garantir que a linhagem celular tenha cariótipo normal, seja negativa para infecção por micoplasma e esteja livre de genomas de plasmídeos ou vetores virais. Além disso, ao usar hiPSCs, é importante evitar o uso da passagem mais antiga, que ainda está passando por reprogramação, para experimentos piloto. Esses experimentos devem se.......
Ines Cherkaoui foi apoiada por uma bolsa de estudos da Diabetes UK (BDA 18/0005934) para a GAR, que também agradece ao Wellcome Trust for an Investigator Award (212625/Z/18/Z), UKRI MRC por uma bolsa do Programa (MR/R022259/1), Diabetes UK for Project grant (BDA16/0005485), CRCHUM para fundos de start-up, Innovation Canada por um John R. Evans Leader Award (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) para uma subvenção de projeto, e CIHR, JDRF para uma concessão de equipe (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Camille Dion e Dr. Harry Leitch por sua ajuda com a geração e cultura de hiPSCs humanos, a instalação de organoides do NIHR Imperial BRC (Biomedical Researc....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube | Starlabs | S1615-5500 | |
6-well Cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 165218 | |
AggreWell 400 6-well plate | STEMCELL Technologies | 34425 | |
Anti-Glucagon | Sigma-aldrich | G2654-100UL | |
Anti-Insulin | Dako | A0564 | |
Anti-NKX6.1 | Novus Biologicals | NBP1-49672SS | |
Anti-PDX1 | Abcam | ab84987 | |
Aphidicolin | Sigma-Aldrich | A4487 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Bovine Serum Albumin, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A3803-100G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C3306 | |
Calcium/Magnesium free D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Cyclopamine-KAAD | Calbiochem | 239804 | |
D-(+)-Glucose,BioXtra | Sigma-Aldrich | G7528 | |
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous | Sigma-Aldrich | 94046-100ML- | |
DMEM plus GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566016 | For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. |
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
Ethanol | VWR | 20821.33 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
Gamma-Secretase Inhibitor XX | Thermo Fisher Scientific | J64904 | |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100. |
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21435 | |
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150187 | |
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher Scientific | A-21052 | |
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H3375-500G | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H1399 | |
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0094 | |
Hydrogen chloride | Sigma-Aldrich | 295426 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Agar Scientific | AGG4582 | |
LDN193189 | Sigma-Aldrich | SML0559-5MG | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272-500G | |
OCT Compound 118 mL | Agar Scientific | AGR1180 | |
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
Penicillin-Streptomycin (PS) | Thermo Fisher Scientific, | 15070-063 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
Recombinant Human EGF Protein | R&D Systems | 236-EG-200 | |
Rectangular cover glasses, 22×50 mm | VWR | 631-0137 | |
RepSox (Hydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72394 | |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 61870036 | For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS. |
Shandon Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
STEMdiff Endoderm | STEMCELL Technologies | 5110 | |
StemFlex Medium | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium. |
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid | Reprocell | 04-0021 | |
Thyroid Tormone 3 (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
TrypL Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P2287-500ML | |
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture | Thermo Fisher Scientific | 38071 | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72302 | |
Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | Z4750 |
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