Protocolo Otimizado para Geração de Células Funcionais Secretoras de Insulina Pancreáticas a partir de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Summary

Este artigo apresenta um protocolo para diferenciação dirigida e análise funcional de células semelhantes a células β. Descrevemos as condições e passagens ideais de cultura para células-tronco pluripotentes humanas antes de gerar células pancreáticas produtoras de insulina. A diferenciação em seis estágios progride desde a formação definitiva da endoderme até células funcionais semelhantes às células β que secretam insulina em resposta à glicose.

Abstract

As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) podem se diferenciar em qualquer tipo de célula, tornando-as uma excelente fonte alternativa de células-β pancreáticas humanas. As hPSCs podem ser células-tronco embrionárias (hESCs) derivadas do blastocisto ou células pluripotentes induzidas (hiPSCs) geradas diretamente de células somáticas usando um processo de reprogramação. Aqui um protocolo baseado em vídeo é apresentado para delinear as condições ideais de cultura e passagem para hPSCs, antes de sua diferenciação e subsequente geração de células pancreáticas produtoras de insulina. Essa metodologia segue o processo de seis estágios para diferenciação dirigida a células β, em que as hPSCs se diferenciam em endoderme (DE) definitiva, tubo intestinal primitivo, destino do intestino anterior, progenitores pancreáticos, progenitores endócrinos pancreáticos e, finalmente, células β pancreáticas. Vale ressaltar que essa metodologia de diferenciação leva um período de 27 dias para gerar as células-β pancreáticas humanas. O potencial de secreção de insulina foi avaliado através de dois experimentos, que incluíram imunomarcação e secreção de insulina estimulada por glicose.

Introduction

As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) têm a capacidade única de se diferenciar em vários tipos celulares, tornando-as uma alternativa viável às células-β pancreáticas humanas¹. Essas hPSCs são categorizadas em dois tipos: células-tronco embrionárias (hESCs), derivadas do blastocisto², e células pluripotentes induzidas (hiPSCs), geradas pela reprogramação direta de células^somáticas3. O desenvolvimento de técnicas para diferenciar hPSCs em células-β tem implicações importantes tanto para a pesquisa fundamental quanto para a prática clínica ^1,4

Protocol

Antes de iniciar a diferenciação, recomenda-se determinar o número necessário de organoides semelhantes a ilhotas para fins experimentais. Em uma placa de 6 poços, um único poço com mais de 80% de confluência normalmente consiste de 2-2,3 milhões de hPSCs. Enquanto uma previsão precisa é desafiadora devido a variações nas linhas de hPSC e eficiência de diferenciação, uma estimativa aproximada é 1,5 vezes o número de poços iniciais. Uma diferenciação efetivamente dirigida geralmente produz 1,6 a 2 mil.......

Discussion

O sucesso da diferenciação das hPSCs em células β pancreáticas depende da otimização de todos os aspectos da cultura de rotina e da passagem das hPSCs selecionadas. Isso inclui garantir que a linhagem celular tenha cariótipo normal, seja negativa para infecção por micoplasma e esteja livre de genomas de plasmídeos ou vetores virais. Além disso, ao usar hiPSCs, é importante evitar o uso da passagem mais antiga, que ainda está passando por reprogramação, para experimentos piloto. Esses experimentos devem se.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube	Starlabs	S1615-5500
6-well Cell culture plate	ThermoFisher Scientific	165218
AggreWell 400 6-well plate	STEMCELL Technologies	34425
Anti-Glucagon	Sigma-aldrich	G2654-100UL
Anti-Insulin	Dako	A0564
Anti-NKX6.1	Novus Biologicals	NBP1-49672SS
Anti-PDX1	Abcam	ab84987
Aphidicolin	Sigma-Aldrich	A4487
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid free	Sigma-Aldrich	A3803-100G
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C3306
Calcium/Magnesium free D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14190144
Cyclopamine-KAAD	Calbiochem	239804
D-(+)-Glucose,BioXtra	Sigma-Aldrich	G7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous	Sigma-Aldrich	94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	10566016	For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS.
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)	Thermo Fisher Scientific	10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides	Thermo Fisher Scientific	10149870
Ethanol	VWR	20821.33
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XX	Thermo Fisher Scientific	J64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647	Abcam	ab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633	Thermo Fisher Scientific	A-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A-11011
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H3375-500G
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	H1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0094
Hydrogen chloride	Sigma-Aldrich	295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Agar Scientific	AGG4582
LDN193189	Sigma-Aldrich	SML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	M9272-500G
OCT Compound 118 mL	Agar Scientific	AGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)	Thermo Fisher Scientific,	15070-063
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Recombinant Human EGF Protein	R&D Systems	236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mm	VWR	631-0137
RepSox (Hydrochloride)	STEMCELL Technologies	72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	61870036	For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S6014-500G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	7558-80-7
STEMdiff Endoderm	STEMCELL Technologies	5110
StemFlex Medium	Thermo Fisher Scientific	A3349401	Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid	Reprocell	04-0021
Thyroid Tormone 3 (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
Trypan Blue Solution, 0.4%	ThermoFisher Scientific	15250061
TrypL Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific	12604013
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture	Thermo Fisher Scientific	38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977015
Y-27632 (Dihydrochloride)	STEMCELL Technologies	72302
Zinc Sulfate	Sigma-Aldrich	Z4750