A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
מוצג פרוטוקול להעשרת חלבוני התא המאכסן (HCPs) ממוצרי תרופות (DP) ואיתור פפטידים באמצעות חרוזי העשרת פרוטאום. השיטה מודגמת באמצעות חומר תרופתי נוגדן חד-שבטי (mAb) (DS), שהוא חומר ייחוס מאופיין היטב להערכה והשוואה של שיטות שונות מבחינת ביצועים.
חלבוני התא המארח (HCPs) הם זיהומים שיכולים להשפיע לרעה על חלבונים טיפוליים, אפילו בכמויות קטנות. כדי להעריך את הסיכונים הפוטנציאליים הקשורים למוצרי תרופות, פותחו שיטות לזיהוי HCP בשפע נמוך. גישה חיונית לפיתוח שיטת זיהוי HCP רגישה כוללת העשרת HCPs ובו זמנית הסרת נוגדנים חד שבטיים (mAbs) לפני הניתוח, תוך שימוש בספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית (LC-MS).
פרוטוקול זה מציע הוראות מפורטות להעשרת חלבוני התא המאכסן באמצעות חרוזי העשרת פרוטאום הזמינים מסחרית. חרוזים אלה מכילים ספרייה מגוונת של ליגנדות הקסה-פפטידים עם זיקות ספציפיות לחלבונים שונים. הפרוטוקול משלב גם עיכול מוגבל וזיהוי פפטידים לאחר מכן באמצעות ננו LC-MS/MS. על ידי שימוש בטכניקות אלה, HCPs עם שפע נמוך ניתן להעשיר מעל 7000 פעמים, וכתוצאה מכך מגבלת זיהוי מרשימה נמוכה כמו 0.002 ppm. באופן משמעותי, פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של 850 HCPs עם רמה גבוהה של ביטחון באמצעות NIST mAb. יתר על כן, הוא נועד להיות ידידותי למשתמש וכולל הדגמת וידאו כדי לסייע ביישומו. על ידי ביצוע צעדים אלה, חוקרים יכולים להעשיר ולזהות ביעילות HCPs, לשפר את הרגישות והדיוק של הערכת סיכונים עבור מוצרי תרופות.
חלבוני התא המארח (HCPs) הם זיהומים המשתחררים מתרבית התאים של האורגניזם המארח ומטוהרים במשותף עם נוגדן חד-שבטי (mAb)1,2,3,4. רמות עקבות של HCPs יכולות להשפיע לרעה על איכות מוצר התרופה 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, ולכן....
הקיצורים המשמשים בפרוטוקול מפורטים בטבלה משלימה 1.
1. הכנת פתרונות ומאגרים
הערה: הפרטים המסחריים של כל הריאגנטים מפורטים בטבלת החומרים.
פרוטוקול זה הציג תהליך הכנת דגימה, המכונה העשרת חלבונים יחד עם עיכול מוגבל (PMLD), לניתוח חלבוני התא המארח (HCPs) בדגימת נוגדנים חד-שבטיים (mAb). איור 1 מדגים את התהליך שלב אחר שלב של PMLD. החוקרים השוו את התוצאות של ניתוח HCP באמצעות עיכול ישיר (מוצג בפאנל העליון של איור 2) ו-PMLD (מוצג בפאנ.......
ישנן שתי גרסאות של חרוזי העשרת חלבון הזמינים באופן מסחרי: אחת עם קיבולת קטנה יותר והשנייה עם קיבולת גדולה יותר (ראה טבלת חומרים). שתי הגרסאות של חרוזי ההעשרה מכילות עשרה פרפים באריזה. הוראות היצרן מציעות כי כל הכנה מתוך ערכת קיבולת קטנה ניתן להשתמש כדי להעשיר 10 מ"ג של חלבון כולל. עם .......
ללא.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3 | Hamilton | 91016 | |
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm) | Thermo Fisher | 164535 | |
Acetonitrile | Fisher-Scientific | A955 | |
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS120-4 | |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Millipore Sigma | UFC5010 | |
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å) | CoAnn Technologies | HEB07503001718I | |
Centrifuge 5424 | Eppendorf | 5405000646 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | A39255 | |
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk | Agilent | 12131020 | |
GL-Tip GC | GL Sciences Inc | 7820-11201 | |
in-house mAb | Regeneron | concentration 200 mg/mL | |
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg) | Thermo Fisher | A39271 | |
Isopropanol | Fisher-Scientific | 149320025 | |
L-Histidine | Sigma Aldrich | H6034 | |
L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma Aldrich | 53370 | |
Methanol | Fisher-Scientific | A456-4 | |
Milli-Q | Millpore | 30035 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | |
Orbitrap Exploris 480 | Thermo Fisher | BRE725539 | |
Protein LoBind Tube 0.5 mL | Eppendorf (VWR) | 22431064 | |
Protein LoBind Tube 2.0 mL | Eppendorf (VWR) | 22431102 | |
Proteome Discoverer software 2.4 | Thermo Scientific | ||
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633007 | |
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit | Bio-Rad | 1633006 | |
Sodium deoxycholate (SDC) | Sigma Aldrich | D6750 | |
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) | Sigma Aldrich | L5777 | |
SpeedVac | Labconco | 7970010 | |
Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | |
Trifluoracetic acid (TFA) | Fisher-Scientific | 28904 | |
Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug) | Promega | V5111 | |
Tube Revolver Rotator | Thermo Fisher | 88881001 | |
UltiMate 3000 RSLC nano system | Thermo Fisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Thermo Fisher | 15568-025 | |
Vortex Genie 2 | VWR | 102091-234 | |
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade | Fisher-Scientific | LS118-4 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved