Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מוצג פרוטוקול להעשרת חלבוני התא המאכסן (HCPs) ממוצרי תרופות (DP) ואיתור פפטידים באמצעות חרוזי העשרת פרוטאום. השיטה מודגמת באמצעות חומר תרופתי נוגדן חד-שבטי (mAb) (DS), שהוא חומר ייחוס מאופיין היטב להערכה והשוואה של שיטות שונות מבחינת ביצועים.

Abstract

חלבוני התא המארח (HCPs) הם זיהומים שיכולים להשפיע לרעה על חלבונים טיפוליים, אפילו בכמויות קטנות. כדי להעריך את הסיכונים הפוטנציאליים הקשורים למוצרי תרופות, פותחו שיטות לזיהוי HCP בשפע נמוך. גישה חיונית לפיתוח שיטת זיהוי HCP רגישה כוללת העשרת HCPs ובו זמנית הסרת נוגדנים חד שבטיים (mAbs) לפני הניתוח, תוך שימוש בספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית (LC-MS).

פרוטוקול זה מציע הוראות מפורטות להעשרת חלבוני התא המאכסן באמצעות חרוזי העשרת פרוטאום הזמינים מסחרית. חרוזים אלה מכילים ספרייה מגוונת של ליגנדות הקסה-פפטידים עם זיקות ספציפיות לחלבונים שונים. הפרוטוקול משלב גם עיכול מוגבל וזיהוי פפטידים לאחר מכן באמצעות ננו LC-MS/MS. על ידי שימוש בטכניקות אלה, HCPs עם שפע נמוך ניתן להעשיר מעל 7000 פעמים, וכתוצאה מכך מגבלת זיהוי מרשימה נמוכה כמו 0.002 ppm. באופן משמעותי, פרוטוקול זה מאפשר זיהוי של 850 HCPs עם רמה גבוהה של ביטחון באמצעות NIST mAb. יתר על כן, הוא נועד להיות ידידותי למשתמש וכולל הדגמת וידאו כדי לסייע ביישומו. על ידי ביצוע צעדים אלה, חוקרים יכולים להעשיר ולזהות ביעילות HCPs, לשפר את הרגישות והדיוק של הערכת סיכונים עבור מוצרי תרופות.

Introduction

חלבוני התא המארח (HCPs) הם זיהומים המשתחררים מתרבית התאים של האורגניזם המארח ומטוהרים במשותף עם נוגדן חד-שבטי (mAb)1,2,3,4. רמות עקבות של HCPs יכולות להשפיע לרעה על איכות מוצר התרופה 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, ולכן....

Protocol

הקיצורים המשמשים בפרוטוקול מפורטים בטבלה משלימה 1.

1. הכנת פתרונות ומאגרים

הערה: הפרטים המסחריים של כל הריאגנטים מפורטים בטבלת החומרים.

  1. הכינו תמיסת 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0 על ידי הוספת 1 מ"ל של 1 M Tris-HCl, pH 8.0 לתוך 9 מ"ל של מים נטולי יונים, בבקב?.......

Representative Results

פרוטוקול זה הציג תהליך הכנת דגימה, המכונה העשרת חלבונים יחד עם עיכול מוגבל (PMLD), לניתוח חלבוני התא המארח (HCPs) בדגימת נוגדנים חד-שבטיים (mAb). איור 1 מדגים את התהליך שלב אחר שלב של PMLD. החוקרים השוו את התוצאות של ניתוח HCP באמצעות עיכול ישיר (מוצג בפאנל העליון של איור 2) ו-PMLD (מוצג בפאנ.......

Discussion

ישנן שתי גרסאות של חרוזי העשרת חלבון הזמינים באופן מסחרי: אחת עם קיבולת קטנה יותר והשנייה עם קיבולת גדולה יותר (ראה טבלת חומרים). שתי הגרסאות של חרוזי ההעשרה מכילות עשרה פרפים באריזה. הוראות היצרן מציעות כי כל הכנה מתוך ערכת קיבולת קטנה ניתן להשתמש כדי להעשיר 10 מ"ג של חלבון כולל. עם .......

Disclosures

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

ללא.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3Hamilton91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm)Thermo Fisher164535
AcetonitrileFisher-ScientificA955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade Fisher-ScientificLS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å)CoAnn TechnologiesHEB07503001718I
Centrifuge 5424Eppendorf5405000646
Dithiothreitol (DTT) Thermo FisherA39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pkAgilent12131020
GL-Tip GCGL Sciences Inc  7820-11201
in-house mAbRegeneronconcentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg)Thermo FisherA39271
IsopropanolFisher-Scientific149320025
L-HistidineSigma AldrichH6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrateSigma Aldrich53370
MethanolFisher-ScientificA456-4 
Milli-QMillpore30035
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000
Orbitrap Exploris 480Thermo FisherBRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mLEppendorf (VWR)22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mLEppendorf (VWR)22431102
Proteome Discoverer software 2.4Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity KitBio-Rad1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity KitBio-Rad1633006
Sodium deoxycholate (SDC)Sigma AldrichD6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) Sigma AldrichL5777
SpeedVacLabconco7970010
Thermomixer REppendorf22670107
Trifluoracetic acid (TFA)Fisher-Scientific28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug)PromegaV5111
Tube Revolver RotatorThermo Fisher88881001
UltiMate 3000 RSLC nano systemThermo FisherULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0Thermo Fisher15568-025
Vortex Genie 2VWR102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade Fisher-ScientificLS118-4 

References

  1. Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
  2. Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE203LC MSProteoMiner

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved