Análise de Proteína de Células Hospedeiras usando Contas de Enriquecimento Acopladas a Digestão Limitada

Summary

Um protocolo é apresentado para o enriquecimento de proteínas da célula hospedeira (HCPs) a partir de produtos farmacêuticos (PD) e detecção de peptídeos usando esferas de enriquecimento de proteoma. O método é demonstrado usando uma substância medicamentosa (MD) de anticorpos monoclonais (mAb) fabricada internamente, que é um material de referência bem caracterizado para avaliar e comparar diferentes métodos em termos de desempenho.

Abstract

As proteínas da célula hospedeira (HCPs) são impurezas que podem afetar adversamente as proteínas terapêuticas, mesmo em pequenas quantidades. Para avaliar os riscos potenciais associados aos medicamentos, métodos têm sido desenvolvidos para identificar PCH de baixa abundância. Uma abordagem crucial para o desenvolvimento de um método sensível de detecção de HCP envolve o enriquecimento de HCPs e, simultaneamente, a remoção de anticorpos monoclonais (mAbs) antes da análise, utilizando cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS).

Este protocolo oferece instruções detalhadas para o enriquecimento de proteínas da célula hospedeira usando esferas de enriquecimento de proteoma comercialmente disponíveis. Essas esferas contêm uma biblioteca diversificada de ligantes hexapeptídicos com afinidades específicas para diferentes proteínas. O protocolo também incorpora digestão limitada e subsequente detecção de peptídeos usando nano LC-MS/MS. Ao empregar essas técnicas, HCPs com baixa abundância podem ser enriquecidos mais de 7000 vezes, resultando em um limite de detecção impressionante tão baixo quanto 0,002 ppm. Significativamente, este protocolo permite a detecção de 850 HCPs com um alto nível de confiança usando um mAb do NIST. Além disso, ele foi projetado para ser fácil de usar e inclui uma demonstração em vídeo para ajudar na sua implementação. Ao seguir essas etapas, os pesquisadores podem efetivamente enriquecer e detectar PCHs, aumentando a sensibilidade e a precisão da avaliação de risco para produtos farmacêuticos.

Introduction

As proteínas da célula hospedeira (PCH) são impurezas liberadas da cultura celular do organismo hospedeiro e copurificadas com anticorpo monoclonal (mAb)1,2,3,4. Níveis traço de PID podem afetar negativamente a qualidade do medicamento 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 e, portanto

Protocol

As abreviaturas utilizadas no protocolo estão listadas na Tabela Suplementar 1.

1. Preparação de soluções e tampões

NOTA: Os detalhes comerciais de todos os reagentes estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparar 0,1 M Tris-HCl, solução de pH 8,0 adicionando 1 mL de 1 M Tris-HCl, pH 8,0 em 9 mL de água deionizada em um frasco para injetáveis de vidro e misturar bem por vórtice. Conservar a 4 .......

Discussion

Existem duas versões de esferas de enriquecimento de proteínas disponíveis comercialmente: uma com menor capacidade e outra com maior capacidade (ver Tabela de Materiais). Ambas as versões das contas de enriquecimento contêm dez preparações no pacote. As instruções do fabricante sugerem que cada preparação do kit de pequena capacidade pode ser usada para enriquecer 10 mg de proteína total. No entanto, para um ótimo desempenho do enriquecimento da proteína da célula hospedeira (HCP) a parti.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3	Hamilton	91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm)	Thermo Fisher	164535
Acetonitrile	Fisher-Scientific	A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å)	CoAnn Technologies	HEB07503001718I
Centrifuge 5424	Eppendorf	5405000646
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher	A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk	Agilent	12131020
GL-Tip GC	GL Sciences Inc	7820-11201
in-house mAb	Regeneron		concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg)	Thermo Fisher	A39271
Isopropanol	Fisher-Scientific	149320025
L-Histidine	Sigma Aldrich	H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate	Sigma Aldrich	53370
Methanol	Fisher-Scientific	A456-4
Milli-Q	Millpore	30035
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000
Orbitrap Exploris 480	Thermo Fisher	BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL	Eppendorf (VWR)	22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL	Eppendorf (VWR)	22431102
Proteome Discoverer software 2.4	Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit	Bio-Rad	1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit	Bio-Rad	1633006
Sodium deoxycholate (SDC)	Sigma Aldrich	D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)	Sigma Aldrich	L5777
SpeedVac	Labconco	7970010
Thermomixer R	Eppendorf	22670107
Trifluoracetic acid (TFA)	Fisher-Scientific	28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug)	Promega	V5111
Tube Revolver Rotator	Thermo Fisher	88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system	Thermo Fisher	ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0	Thermo Fisher	15568-025
Vortex Genie 2	VWR	102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS118-4