מודל חזירי כירורגי של איסכמיה כרונית של שריר הלב מטופל על ידי מדבקת קולגן עמוסת אקסוזום והשתלת מעקף עורקים כליליים מחוץ למשאבה

Summary

מחקר זה מציג מודל כירורגי חזירי של איסכמיה כרונית של שריר הלב עקב היצרות מתקדמת של העורקים הכליליים, וכתוצאה מכך תפקוד לב לקוי ללא אוטם. לאחר איסכמיה, בעלי חיים עוברים השתלת מעקף עורקים כליליים מחוץ למשאבה עם מיקום אפיקרדיאלי של מדבקת קולגן עמוסת אקסוזומים שמקורם בתאי גזע. טיפול משלים זה משפר את תפקוד שריר הלב ואת ההתאוששות.

Abstract

איסכמיה כרונית של שריר הלב הנובעת מהיצרות מתקדמת של העורקים הכליליים מובילה לתרדמת חורף (HIB), המוגדרת כשריר הלב המסתגל לזמינות חמצן מופחתת על ידי הפחתת הפעילות המטבולית, ובכך מונע פגיעה בלתי הפיכה בקרדיומיוציטים ואוטם. זאת להבדיל מאוטם שריר הלב, שכן ל-HIB יש פוטנציאל להחלמה עם רה-וסקולריזציה. חולים עם מחלת עורקים כלילית משמעותית (CAD) חווים איסכמיה כרונית, אשר מציבה אותם בסיכון לאי ספיקת לב ומוות פתאומי. ההתערבות הכירורגית הסטנדרטית עבור CAD חמור היא ניתוח השתלת עורק כלילי (CABG), אך היא הוכחה כטיפול לא מושלם, אך עדיין לא קיימים טיפולים משלימים לשחזור מיוציטים המותאמים לאיסכמיה כרונית. כדי להתמודד עם פער זה, נעשה שימוש במודל כירורגי של HIB באמצעות חזיר המקובל על CABG ומחקה את התרחיש הקליני. המודל כולל שני ניתוחים. הניתוח הראשון כולל השתלת מכווץ קשיח בקוטר 1.5 מ"מ בעורק היורד הקדמי השמאלי (LAD). ככל שהחיה גדלה, המכווץ גורם בהדרגה להיצרות משמעותית וכתוצאה מכך לתפקוד סיסטולי אזורי מופחת. ברגע שההיצרות מגיעה ל-80%, זרימת שריר הלב ותפקודו נפגעים, מה שיוצר HIB. לאחר מכן מתבצע CABG מחוץ למשאבה עם עורק החלב הפנימי השמאלי (LIMA) כדי לחדש את האזור האיסכמי. בעל החיים מתאושש למשך חודש כדי לאפשר שיפור אופטימלי בשריר הלב לפני ההקרבה. זה מאפשר מחקרים פיזיולוגיים ורקמות של קבוצות טיפול שונות. מודל בעלי חיים זה מדגים כי תפקוד הלב נותר לקוי למרות CABG, מה שמרמז על הצורך בהתערבויות משלימות חדשניות. במחקר זה פותחה מדבקת קולגן המשובצת באקסוזומים שמקורם בתאי גזע מזנכימליים (MSC), אשר ניתן למרוח בניתוח על פני השטח האפיקרדיאליים הדיסטליים לאנסטומוזיס לימה (LIMA anastomosis). החומר מתאים לאפיקרדיום, נספג ומספק את הפיגום לשחרור מתמשך של גורמי איתות. טיפול רגנרטיבי זה יכול לעורר התאוששות שריר הלב שאינה מגיבה לרה-וסקולריזציה בלבד. מודל זה מתורגם לזירה הקלינית על ידי מתן אמצעים לחקירה פיזיולוגית ומכניסטית לגבי החלמה ב- HIB.

Introduction

ברחבי העולם, CAD חמור משפיע על יותר ממאה מיליון חולים, ולמרות שיעור התמותה ירד, זה נשאר אחד הגורמים המובילים למוות ^1,2. ל- CAD יש ספקטרום קליני רחב מאוטם שריר הלב (MI) ועד איסכמיה עם כדאיות שמורה. רוב המחקר הפרה-קליני מתמקד ב-MI, המאופיין בנוכחות רקמה אוטמת כפי שניתן ללמוד במודלים של בעלי חיים קטנים וגדולים. עם זאת, מודל זה אינו מתייחס לחולים עם כדאיות שמורה ומקובלת על רה-וסקולריזציה. רוב החולים העוברים CABG סובלים מירידה באספקת הדם ומתפקוד מוגבל תוך שמירה על שונות ברזרבה התכווצה ובכדאיות³. ללא טיפול, חולים אלה יכולים להתקדם לאי ספיקת לב מתקדמת ומוות פתאומי, במיוחד במהלך עומס עבודה מוגב....

Protocol

הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של המרכז הרפואי מיניאפוליס VA ואוניברסיטת מינסוטה אישרו את כל המחקרים בבעלי חיים. ההנחיות הנוכחיות של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) לשימוש וטיפול בחיות מעבדה בוצעו.

1. בידוד תאי גזע מזנכימליים והכנה ואפיון אקסוזומים

Discussion

מחקר זה מציג את המודל החזירי הראשון של שריר הלב האיסכמי הכרוני, שבו הוכח כי טיפול במדבקת קולגן אקסוזום עמוס אקסוזום שמקורה ב- MSC במהלך רה-וסקולריזציה כירורגית משחזר תפקוד דיאסטולי וסיסטולי עם גירוי אינוטרופי פוטנציאלי על ידי התמקדות בהתאוששות מיטוכונדריאלית. בעבר, הוכח כי במודל בעלי חיים .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5 Ethibond	Ethicon	MG46G	Suture
# 40 clipper blade	Oster	078919-016-701	Remove hair from surgery sites
0 Vicryl	Ethicon	J208H	Suture
1 mL Syringe	Medtronic/Covidien	1188100777	Administer injectable agents
1" medical tape	Medline	MMM15271Z	Secure wound dressing and IV catheters
1000mL 0.9% Sodium chloride	Baxter	2B1324X	IV replacement fluid
12 mL Syringe	Medtronic/Covidien	8881512878	Administer injectable agents
18 ga needles	BD	305185	Administration of injectable agents
20 ga needles	BD	305175	Administration of injectable agents
20 mL Syringe	Medtronic/Covidien	8881520657	Administer injectable agents
2-0 Vicryl	Ethicon	J317H	Suture
250 mL 0.9% saline	Baxter	UE1322D	Replacement IV Fluid
3 mL Syinge	Medtronic/Covidien	1180300555	Administer injectable agents
3-0 Vicryl	Ethicon	VCP824G	Suture
36” Pressure monitoring tubing	Smith’s Medical	MX563	Connect art. Line  to transducer
4.0 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43040	Establish airway for Hibernation
4-0 Tevdek II Strands	Deknatel	7-922	Suture to secure constrictor around LAD
48” Pressure monitoring tubing	Smith’s Medical	MX564	Connect art. Line  to transducer
500mL 0.9% Sodium chloride	Baxter	2B1323Q	Drug delivery, Provide mist for Blower Mister
6  mL Syringe	Medtronic/Covidien	1180600777	Administer injectable agents
6.0 mm ID endotracheal tube	Mallinckrodt	86049	Establish airway for Revasc,MRI and Termination
6.5 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43065	Establish airway for Revasc,MRI and Termination
6” pressure tubing line	Smith’s Medical	MX560	Collect bone marrow
60 mL Syringe	Medtronic/Covidien	8881560125	Administer injectable agents
7.0 mm ID endotracheal tube	Medline	DYND43070	Establish airway for Revasc,MRI and Termination
7-0 Prolene	Ethicon	M8702	Suture
Advanced DMEM (1X)	ThermoFisher Scientific	12491023
Alcohol Prep pads	MedSource	MS-17402	Skin disinfectant
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC910024
Anesthesia Machine	Drager	Fabious Trio	maintains general anesthesia
Anesthesia Machine + ventilator	DRE Drager- Fabius Tiro	DRE0603FT	Deliver Oxygen and inhalant to patient
Anesthesia Monitor	Phillips  Intellivue	MP70	Multiparameter for patient safety
Arterial Line Kit	Arrow	ASK-04510-HF	Femoral catheter for blood pressure monitoring
Artificial Tears	Rugby	0536-1086-91	Lubricate eyes to prevent corneal drying
Bair Hugger	3M	Model 505	Patient Warming system
Basic pack	Medline	DYNJP1000	Sterile drapes and table cover
Blood Collection Tubes- green top	Fisher Scientific	02-689-7	Collect microsphere blood samples
Blower Mister Kit	Medtronic/Covidien	22120	Clears surgical field for vessel anastomosis
BODIPY TR Ceramide	ThermoFisher Scientific	D7540
Bone marrow needle- 25mm 15 ga IO needle	Vidacare	9001-VC-005	Collect bone marrow
Bone Wax	Medline	ETHW31G	Hemostasis of cut bone
Bovie Cautery hand piece	Covidien	E2516	Hemostasis
Bupivicaine	Pfizer	00409-1161-01	Local Anesthetic
Buprenorphine 0.3 mg/mL	Sigma Aldrich	B9275	Pre operative Analgesic for survivial procedures
Cell Scrapers	Corning	353085
Cephazolin 1 gr	Pfizer	00409-0805-01	Antibiotic
Chest Tube	Covidien	8888561043	Evacuates air from chest cavity
Cloroprep	Becton Dickenson	260815	Surgical skin prep
Corning bottle-top vacuum Filter System (500mL)	Millipore Sigma	430758
CPT tube	BD	362753	MSC isolation from bone marrow
Delrin Constrictor	U of MN	Custom made	Creates stenosis of LAD
Dermabond	Ethicon	DNX12	Skin adhesive
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium, HEPES	ThermoFisher Scientific	12430062
Dobutamine 12.5 mg/mL	Pfizer	00409-2344-01	Increases blood pressure and heart rate during the second microsphere blood collection
ECG Pads	DRE	1496	Monitor heart rhythm
Exosome-Depleted FBS	ThermoFisher Scientific	A2720801
Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets, Sterile, 10mL	Fisher Scientific	13-675-20
Femoral and carotid introducer	Cordis- J&J	504606P	femoral and carotis cannulas
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated, Gibco FBS	ThermoFisher Scientific	16140089
Flo-thru 1.0	Baxter	FT-12100	used to anastomos LIMA to L
Flo-thru 1.25	Baxter	FT-12125	FT-12125
Flo-thru 1.5	Baxter	FT-12150	FT-12150
Flo-thru 2.0	Baxter	FT-12200	FT-12200
GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Hair Clipper	Oster	078566-011-002	Remove hair from surgery sites
Helistat collagen sponge	McKesson	570973 1690ZZ	Sponge for embedding exosomes
Heparin	Pfizer	0409-2720-03	anticoaggulant
Histology Jars	Fisher Scientific	316-154	Formalin for tissue samples
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva	SH30071.03
Hypafix	BSN Medical	4210	Secure wound dressing and IV catheters
Isoflurane	Sigma Aldrich	CDS019936	General Anesthestic- Inhalant
IV Tubing for Blower Mister	Carefusion	42493E	Adapts to IV Fluids for Blower/Mister
Jelco 18 ga IV catheter	Smiths medical	4054	IV access in Revasc, MRI and Term
Lidocaine 2%	Pfizer	00409-4277-01	Local Anesthetic/ antiarrthymic
Ligaclips	Ethicon	MSC20	Surgical Staples for LIMA takedown
Long blade for laryngoscope	DRE	12521	Allows for visualization of trachea for intubation
Meloxicam 5 mg/mL	Boehringer Ingelheim	141-219	Post operative Analgesic
Microsphere pump			Collect blood samples from femoral introducer
Monopolar Cautery	Covidien	Valleylab™ FT10	Hemostasis
Nanosight NS 300	Malvern Panalytical	MAN0541-03-EN
NTA 3.1.54 software	Malvern Panalytical	MAN0520-01-EN-00
OPVAC Synergy II	Terumo Cardiovascular System	401-230	Heart positioner and Stabilizer
Oxygen Tank E cylinder	various	various	Used for Blower Mister if anesthesia machine doesn't have auxiliary flow meter
PBS, pH 7.2	ThermoFisher Scientific	20012050
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic Mixture	ThermoFisher Scientific	15640055
Pigtail 145 catheter 6 French	Boston Scientific	08641-41	Measure LV pressures
Pressure Transducer	various	Must adapt to anesthesia monitor	Monitor direct arterial pressures
Propofol	Diprivan	269-29	Induction agent
Roncuronium	Mylan	67457-228-05	Neuromuscular blocking agent
SR Buprenorphine 10 mg/mL	Abbott Labs	NADA 141-434	Post operative Analgesic
Sterile Saline 20 mL	Fisher Scientific	20T700220	Flush for IV catheters
Sternal Saw/ Necropsy Saw	Thermo Fisher	812822	Used to open chest cavity
Stop Cocks	Smith Medical	MX5311L	2 to connect to pig tail
Succinylcholine 20 mg/mL	Pfizer	00409-6629-02	Neuromuscular blocking agent
Suction  tubing	Medline	DYND50223
Suction Container	Medline	DYNDCL03000
Surgery pack with chest retractor	various	See pack list	Femoral cut down and median sternotomy
Surgical Instruments	various	See pack list	Femoral and carotid cutdowns and sternotomy
Surgical Spring Clip	Applied Medical	A1801	Clamp end of LIMA after takedown
Syringe pump	Harvard		Delivers IV Dobutamine infusion
SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSO	Millipore Sigma	S32703
Telazol 100 mg/mL	Fort Dodge	01L60030	Pre operative Sedative
Telpha pad	Covidien	2132	Sterile wound dressing
Timer			Time collection of blood samples
Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media)	ThermoFisher Scientific	4478359
TPP Tissue Culture Flask, T75, Filter Cap w/ 0.22uM PTFE	ThermoFisher Scientific	TP90076
Triple Antibiotic Ointment	Johnson & Johnson	23734	Topical over wound
Vicryl mesh	Ethicon	VKML	Patch for epicardial cell application
Vortex			Mix microspheres
Xylazine 100 mg/mL	Vedco	468RX	Pre operative Sedative/ analgesic