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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este estudo apresenta um modelo cirúrgico porcino de isquemia miocárdica crônica por estenose progressiva da artéria coronária, resultando em comprometimento da função cardíaca sem infarto. Após a isquemia, os animais são submetidos à cirurgia de revascularização do miocárdio sem circulação extracorpórea com colocação epicárdica de adesivo carregado de exossomos derivado de células-tronco. Essa terapia adjuvante melhora a função e a recuperação miocárdica.

Abstract

A isquemia miocárdica crônica decorrente da estenose coronariana progressiva leva ao miocárdio hibernante (HIB), definido como miocárdio que se adapta à redução da disponibilidade de oxigênio por meio da redução da atividade metabólica, prevenindo a lesão irreversível dos cardiomiócitos e o infarto. Isso é distinto do infarto do miocárdio, pois o HIB tem potencial de recuperação com revascularização. Pacientes com doença arterial coronariana (DAC) significativa experimentam isquemia crônica, o que os coloca em risco de insuficiência cardíaca e morte súbita. A intervenção cirúrgica padrão para DAC grave é a cirurgia de revascularização miocárdica (CRM), mas tem se mostrado uma terapia imperfeita, mas não existem terapias adjuvantes para recuperar miócitos adaptados à isquemia crônica. Para suprir essa lacuna, foi utilizado um modelo cirúrgico de HIB utilizando porcinos que é passível de revascularização miocárdica e mimetiza o cenário clínico. O modelo envolve duas cirurgias. A primeira operação envolve o implante de um constritor rígido de 1,5 mm na artéria descendente anterior (DAE). À medida que o animal cresce, o constritor gradualmente causa estenose significativa, resultando em redução da função sistólica regional. Quando a estenose atinge 80%, o fluxo e a função miocárdica ficam prejudicados, criando a HIB. Em seguida, é realizada uma CRM sem CEC com a artéria mamária interna esquerda (LIMA) para revascularizar a região isquêmica. O animal se recupera por um mês para permitir uma melhora miocárdica ideal antes do sacrifício. Isso permite estudos fisiológicos e teciduais de diferentes grupos de tratamento. Esse modelo animal demonstra que a função cardíaca permanece comprometida apesar da CRM, sugerindo a necessidade de novas intervenções adjuvantes. Neste estudo, foi desenvolvido um adesivo de colágeno embutido em exossomos derivados de células-tronco mesenquimais (CTM), que pode ser aplicado cirurgicamente na superfície epicárdica distal à anastomose com LIMA. O material está em conformidade com o epicárdio, é absorvível e fornece o arcabouço para a liberação sustentada de fatores de sinalização. Essa terapia regenerativa pode estimular a recuperação miocárdica que não responde apenas à revascularização. Esse modelo se traduz na área clínica, fornecendo meios de exploração fisiológica e mecanicista sobre a recuperação em HIB.

Introduction

Globalmente, a DAC grave afeta mais de cem milhões de pacientes e, embora a taxa de mortalidade tenha diminuído, continua sendo uma das principais causas de morte 1,2. A DAC tem um amplo espectro clínico, desde infarto do miocárdio (IAM) até isquemia com viabilidade preservada. A maioria das pesquisas pré-clínicas concentra-se na IM, caracterizada pela presença de tecido infartado, pois é possível estudar em modelos animais de pequeno e grande porte. Entretanto, esse modelo não contempla pacientes com viabilidade preservada e passíveis de revascularização. A maioria dos pacientes submetidos à CRM apresenta sup....

Protocol

Os Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Minneapolis VA Medical Center e da Universidade de Minnesota aprovaram todos os estudos com animais. As diretrizes atuais do National Institutes of Health (NIH) para o uso e cuidados com animais de laboratório foram seguidas.

1. Isolamento de células-tronco mesenquimais e preparação e caracterização de exossomos

  1. Isolamento de células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas da medula óssea
    1. .......

Representative Results

Após a revascularização, a cineangiocoronariografia é realizada para avaliar a estenose da DAE (maior que 80%) e a patência do enxerto LIMA-LAD (Figura 1). Quatro semanas após a cirurgia de revascularização e colocação do adesivo de colágeno carregado de exossomos, a RMC cardíaca é realizada para avaliar a função sistólica e diastólica do coração em repouso e sob estresse usando infusão de dobutamina em baixas doses a 5μg/kg/min. A função sistólica é analisada medind.......

Discussion

Este estudo apresenta o primeiro modelo porcino de miocárdio cronicamente isquêmico, no qual foi demonstrado que o tratamento com um adesivo carregado de colágeno carregado de exossomo derivado de CTM durante a revascularização cirúrgica recupera a função diastólica e sistólica mediante estimulação inotrópica, potencialmente visando a recuperação mitocondrial. Anteriormente, foi demonstrado que, em um modelo animal de grande porte de HIB, a função diastólica e sistólica, medida pela RMC cardíaca, perm.......

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo VA Merit Review #I01 BX000760 (RFK) dos Estados Unidos (EUA) Departamento de Assuntos de Veteranos BLR&D e Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA concedem #I01 BX004146 (TAB). Também agradecemos o apoio do Instituto do Coração Lillehei da Universidade de Minnesota. O conteúdo deste trabalho não representa a opinião do Departamento de Assuntos de Veteranos dos EUA do Governo dos Estados Unidos.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5 EthibondEthiconMG46GSuture
# 40 clipper bladeOster078919-016-701Remove hair from surgery sites
0 VicrylEthiconJ208HSuture
1 mL SyringeMedtronic/Covidien1188100777Administer injectable agents
1" medical tapeMedlineMMM15271ZSecure wound dressing and IV catheters
1000mL 0.9% Sodium chlorideBaxter2B1324XIV replacement fluid
12 mL SyringeMedtronic/Covidien8881512878Administer injectable agents
18 ga needlesBD305185Administration of injectable agents
20 ga needlesBD305175Administration of injectable agents
20 mL SyringeMedtronic/Covidien8881520657Administer injectable agents
2-0 VicrylEthiconJ317HSuture
250 mL 0.9% salineBaxter UE1322DReplacement IV Fluid
3 mL SyingeMedtronic/Covidien1180300555Administer injectable agents
3-0 VicrylEthiconVCP824GSuture
36” Pressure monitoring tubingSmith’s MedicalMX563Connect art. Line  to transducer
4.0 mm ID endotracheal tubeMedlineDYND43040Establish airway for Hibernation
4-0 Tevdek II StrandsDeknatel7-922Suture to secure constrictor around LAD
48” Pressure monitoring tubingSmith’s MedicalMX564Connect art. Line  to transducer
500mL 0.9% Sodium chlorideBaxter2B1323QDrug delivery, Provide mist for Blower Mister
6  mL SyringeMedtronic/Covidien1180600777Administer injectable agents
6.0 mm ID endotracheal tubeMallinckrodt86049Establish airway for Revasc,MRI and Termination
6.5 mm ID endotracheal tubeMedlineDYND43065Establish airway for Revasc,MRI and Termination
6” pressure tubing lineSmith’s MedicalMX560Collect bone marrow
60 mL SyringeMedtronic/Covidien8881560125Administer injectable agents
7.0 mm ID endotracheal tubeMedlineDYND43070Establish airway for Revasc,MRI and Termination
7-0 ProleneEthiconM8702Suture
Advanced DMEM (1X)ThermoFisher Scientific12491023
Alcohol Prep padsMedSourceMS-17402Skin disinfectant
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC910024
Anesthesia MachineDragerFabious Triomaintains general anesthesia
Anesthesia Machine + ventilatorDRE Drager- Fabius TiroDRE0603FTDeliver Oxygen and inhalant to patient
Anesthesia MonitorPhillips  IntellivueMP70Multiparameter for patient safety
Arterial Line KitArrowASK-04510-HFFemoral catheter for blood pressure monitoring
Artificial TearsRugby0536-1086-91Lubricate eyes to prevent corneal drying
Bair Hugger3MModel 505Patient Warming system
Basic packMedlineDYNJP1000Sterile drapes and table cover
Blood Collection Tubes- green topFisher Scientific02-689-7Collect microsphere blood samples
Blower Mister KitMedtronic/Covidien22120Clears surgical field for vessel anastomosis
BODIPY TR CeramideThermoFisher ScientificD7540
Bone marrow needle- 25mm 15 ga IO needleVidacare9001-VC-005Collect bone marrow
Bone WaxMedlineETHW31GHemostasis of cut bone
Bovie Cautery hand pieceCovidienE2516Hemostasis
BupivicainePfizer00409-1161-01Local Anesthetic
Buprenorphine 0.3 mg/mLSigma AldrichB9275Pre operative Analgesic for survivial procedures
Cell ScrapersCorning353085
Cephazolin 1 grPfizer00409-0805-01Antibiotic
Chest TubeCovidien8888561043Evacuates air from chest cavity
CloroprepBecton Dickenson260815Surgical skin prep
Corning bottle-top vacuum Filter System (500mL)Millipore Sigma430758
CPT tubeBD362753MSC isolation from bone marrow
Delrin ConstrictorU of MNCustom madeCreates stenosis of LAD
DermabondEthiconDNX12Skin adhesive
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium, HEPESThermoFisher Scientific12430062
Dobutamine 12.5 mg/mLPfizer00409-2344-01Increases blood pressure and heart rate during the second microsphere blood collection
ECG PadsDRE1496Monitor heart rhythm
Exosome-Depleted FBSThermoFisher ScientificA2720801
Falcon Disposable Polystyrene Serological Pipets, Sterile, 10mLFisher Scientific13-675-20
Femoral and carotid introducerCordis- J&J504606Pfemoral and carotis cannulas
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated, Gibco FBSThermoFisher Scientific16140089
Flo-thru 1.0BaxterFT-12100used to anastomos LIMA to L
Flo-thru 1.25BaxterFT-12125FT-12125
Flo-thru 1.5BaxterFT-12150FT-12150
Flo-thru 2.0BaxterFT-12200FT-12200
GlutaMAX SupplementThermoFisher Scientific35050061
Hair ClipperOster078566-011-002Remove hair from surgery sites
Helistat collagen spongeMcKesson570973 1690ZZSponge for embedding exosomes
HeparinPfizer 0409-2720-03anticoaggulant
Histology JarsFisher Scientific316-154Formalin for tissue samples
HyClone Characterized Fetal Bovine Serum (FBS)CytivaSH30071.03
HypafixBSN Medical4210Secure wound dressing and IV catheters
IsofluraneSigma AldrichCDS019936General Anesthestic- Inhalant
IV Tubing for Blower MisterCarefusion42493EAdapts to IV Fluids for Blower/Mister
Jelco 18 ga IV catheterSmiths medical4054IV access in Revasc, MRI and Term
Lidocaine 2%Pfizer00409-4277-01Local Anesthetic/ antiarrthymic
LigaclipsEthiconMSC20Surgical Staples for LIMA takedown
Long blade for laryngoscopeDRE12521Allows for visualization of trachea for intubation
Meloxicam 5 mg/mLBoehringer Ingelheim141-219Post operative Analgesic
Microsphere pumpCollect blood samples from femoral introducer
Monopolar CauteryCovidienValleylab™ FT10Hemostasis
Nanosight NS 300Malvern PanalyticalMAN0541-03-EN
NTA 3.1.54 softwareMalvern PanalyticalMAN0520-01-EN-00
OPVAC Synergy IITerumo Cardiovascular System401-230Heart positioner and Stabilizer
Oxygen Tank E cylindervariousvariousUsed for Blower Mister if anesthesia machine doesn't have auxiliary flow meter
PBS, pH 7.2ThermoFisher Scientific20012050
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) Antibiotic MixtureThermoFisher Scientific15640055
Pigtail 145 catheter 6 FrenchBoston Scientific08641-41Measure LV pressures
Pressure TransducervariousMust adapt to anesthesia monitorMonitor direct arterial pressures
PropofolDiprivan269-29Induction agent
RoncuroniumMylan67457-228-05Neuromuscular blocking agent
SR Buprenorphine 10 mg/mLAbbott LabsNADA 141-434Post operative Analgesic
Sterile Saline 20 mLFisher Scientific20T700220Flush for IV catheters
Sternal Saw/ Necropsy SawThermo Fisher812822Used to open chest cavity
Stop CocksSmith MedicalMX5311L2 to connect to pig tail
Succinylcholine 20 mg/mLPfizer00409-6629-02Neuromuscular blocking agent
Suction  tubingMedlineDYND50223
Suction ContainerMedlineDYNDCL03000
Surgery pack with chest retractorvariousSee pack listFemoral cut down and median sternotomy
Surgical InstrumentsvariousSee pack listFemoral and carotid cutdowns and sternotomy
Surgical Spring ClipApplied MedicalA1801Clamp end of LIMA after takedown
Syringe pumpHarvardDelivers IV Dobutamine infusion
SYTO RNASelect Green Fluorescent cell Stain - 5 mM Solution in DMSOMillipore SigmaS32703
Telazol 100 mg/mLFort Dodge01L60030Pre operative Sedative
Telpha padCovidien2132Sterile wound dressing
TimerTime collection of blood samples
Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media)ThermoFisher Scientific4478359
TPP Tissue Culture Flask, T75, Filter Cap w/ 0.22uM PTFEThermoFisher ScientificTP90076
Triple Antibiotic OintmentJohnson & Johnson23734Topical over wound
Vicryl meshEthiconVKMLPatch for epicardial cell application
VortexMix microspheres
Xylazine 100 mg/mLVedco468RXPre operative Sedative/ analgesic

References

  1. Dai, H., et al. Global, regional, and burden of ischaemic heart disease and its attributable risk factors, 1990-2017: results from the Global Burden of Disease Study 2017. European heart journal. Quality of care & clinical outcomes. 8 (1), 50-60 (2022).
  2. Tsao, C. W., et al.

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