הפלה ממוקדת של גנים במקלעת הכורואיד

Summary

במאמר זה אנו מתארים שיטה לשינוי סלקטיבי של ביטויי גנים במקלעת הכורואידים, תוך הימנעות מכל השפעה באזורים אחרים במוח.

Abstract

מקלעת הכורואיד (ChP) משמשת שער קריטי לחדירת תאי מערכת החיסון למערכת העצבים המרכזית (CNS) בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד. מחקרים אחרונים הראו כי ויסות פעילות ChP עשוי להציע הגנה מפני הפרעות במערכת העצבים המרכזית. עם זאת, חקר התפקוד הביולוגי של ChP מבלי להשפיע על אזורי מוח אחרים הוא מאתגר בשל המבנה העדין שלו. מחקר זה מציג שיטה חדשנית להפלה גנטית ברקמת ChP באמצעות וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) או חלבון רקומבינאז רקומבינאז (Cyclization recombination enzyme (Cre) המורכב מרצף TAT (CRE-TAT). התוצאות מראות כי לאחר הזרקת AAV או CRE-TAT לחדר הצידי, הפלואורסצנטיות התרכזה באופן בלעדי ב- ChP. באמצעות גישה זו, המחקר הפיל בהצלחה את קולטן אדנוזין A 2A (A_2A R) ב- ChP באמצעות הפרעותRNA (RNAi) או Cre/locus של מערכות X-overP1 (Cre/LoxP), והראה כי הפלה זו יכולה להקל על הפתולוגיה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE). טכניקה זו עשויה להיות השלכות חשובות על מחקר עתידי על תפקיד ChP בהפרעות CNS.

Introduction

מקלעת הכורואיד (ChP) נחשבה לעתים קרובות כמסייעת בשמירה על הומאוסטזיס תפקודי במוח על ידי הפרשת נוזל מוחי שדרתי (CSF) וגורם נוירוטרופי מוחי (BDNF)^1,2. מחקר הולך וגובר בשלושת העשורים האחרונים גילה כי ChP מייצג מסלול ברור לחדירת תאי מערכת החיסון למערכת העצבים המרכזית (CNS).

הצמתים הצפופים (TJs) של ChP, המורכבים מאפיתל ChP חד-שכבתי, שומרים על הומאוסטזיס חיסוני על ידי מניעת כניסת מקרומולקולות ותאי חיסון למוח³. עם זאת, בתנאים פתולוגיים מסוימים, רקמת ChP מזהה ומגיבה לדפוסים מולקולריים הקשורים לסכנה (DAMPs) ב- CSF ובדם, מה שמוביל לחדירה חיסונית חריגה ולתפקוד לקוי של ה....

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים במחקר זה נערכו בהתאם להנחיות המפורטות במדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטה הרפואית וונג'ואו.

1. בעלי חיים

1. רכשו עכברי C57BL/6 זכרים בגילאי 8-12 שבועות ובמשקל 20-22 גרם.
<.......

Discussion

המחקר הציג שתי גישות שונות להפלה ממוקדת של גנים ChP. הגישה הראשונה כללה הזרקת ICV של CRE-TAT, המכיל Cre recombinase, לעכברי A_2AR flox^/flox. הגישה השנייה כללה הזרקת ICV של AAV2/5 הנושא shRNA של A_2AR. על ידי שימוש בשתי אסטרטגיות אלה, העבודה השיגה את ההפלה הסלקטיבית של A 2A R בתוך ChP והצליחה להדגים את ההשפעות ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
A2ARflox/flox mice	State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus	Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD	pt-4828
antifade mounting medium	Beyotime Biotechnology	0100-01
borosilicate glass capillary	Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd	B100-50-10
brain stereotaxic apparatus	RWD, Shenzhen	69100
C57BL/6 mice	Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company
CRE-TAT recombinase	Millipore	SCR508
DAPI	Absin	B25A031
frozen slicing machine	Leica	CM1950
H37Ra	Becton Dickinson and company	231141
Hamilton syringe	Hamilton, American	P/N: 86259
Incomplete Freunds adjuvant	Sigma	F5506
Laser confocal microscope	Zeiss	LSM900
MOG35-55	Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD	4010006243
OCT glue	Epredia	6502p
paraformaldehyde	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	30525-89-4
pentobarbital sodium	Boyun Biotech	PC13003
Pipette gun	Eppendorf	N45014F
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit	Takara	6110A
Real- Time PCR System	BioRad	CFX96
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice	Jackson Laboratory
sucrose	Sangon Biotech	A502792-0500
super high speed homogenizer	IKA	3737025
Trizol	Invitrogen	15596026
xylene solution	Chengdu Kelong Chemical Reagent Company	1330-20-7