Использование эксплантов птичьей кожи для изучения структуры тканей и органогенеза

Summary

Здесь мы описываем протоколы для трех типов культур эксплантации кожи эмбрионов птиц, которые могут быть использованы для изучения тканевых взаимодействий, 4D-визуализации таймлапс-пленки (3D плюс время), глобальных или локальных возмущений молекулярной функции и характеристик системной биологии.

Abstract

Развивающаяся птичья кожа во время эмбриогенеза является уникальной моделью, которая может дать ценную информацию о структуре тканей. Здесь описаны три вариации культур эксплантов кожи для изучения различных аспектов развития кожи. Во-первых, культивирование органов ex vivo и манипуляции с ними дают исследователям возможность наблюдать и изучать развитие перьевых почек напрямую. Культура кожных эксплантов может расти в течение 7 дней, что позволяет проводить прямой анализ клеточного поведения и получать 4D-визуализацию с интервалами в течение этого периода роста. Это также позволяет проводить физические и молекулярные манипуляции с условиями культивирования для визуализации реакции тканей. Например, бусины, покрытые фактором роста, могут наноситься локально, чтобы вызвать изменения в рисунке перьев на ограниченной площади. В качестве альтернативы, вирусная трансдукция может быть доставлена глобально в питательных средах для повышения или понижения экспрессии генов. Во-вторых, протокол рекомбинации кожи позволяет исследователям исследовать тканевые взаимодействия между эпидермисом и мезенхимой, которые происходят из разных областей кожи, разных этапов жизни или разных видов. Это дает возможность проверить временное окно, в течение которого эпителий способен реагировать на сигналы, и его способность формировать различные придатки кожи в ответ на сигналы от различных мезенхимальных источников. В-третьих, восстановление кожи с использованием диссоциированных дермальных клеток, покрытых интактным эпителием, обнуляет развитие кожи и позволяет изучить начальные процессы периодического формирования паттернов. Этот подход также расширяет наши возможности по манипулированию экспрессией генов среди диссоциированных клеток перед созданием восстановленного кожного экспланта. В этой статье представлены три протокола культивирования и примеры экспериментов, демонстрирующие их полезность.

Introduction

Развитие кожи птичьего эмбриона является отличной моделью для изучения механизмов морфогенеза из-за его особенностей и доступности к микрохирургии и манипуляциям ^1,2. Тем не менее, оценка клеточных и молекулярных событий в интактных тканях может быть затруднена, потому что присутствие посторонних тканей может усложнить микроскопические наблюдения. Кроме того, способность манипулировать экспрессией генов для проверки их роли в морфогенезе кожи не всегда является простой задачей. Мы обнаружили, что можем проверить функции генов с помощью ретровирусной трансдукции с более высоким уровнем успеха на моделях эксплан....

Protocol

1. Культура экспланта куриной кожи (рисунок 1)

1. Оплодотворенные куриные яйца инкубируют во влажном инкубаторе при температуре 38 °C и устанавливают их в соответствии с Hamburger и Hamilton¹⁴.
   1. На стадии 28 (~E5.5) второй палец и третий пале.......

Discussion

Рекомбинация тканей обеспечивает анализ для изучения уникального вклада эпителия и мезенхимы. У цыплят перья начинают развиваться на эмбриональный день 7 (Е7), в то время как чешуя начинается на Е9. Когда чешуйчатая мезенхима Е9 рекомбинируется с перьевым эпителием Е7, рекомбинированная .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042