Gli array di nanofibre sono stati fabbricati presso il Centro per le scienze dei materiali di Nanophase, che è un Dipartimento di Energia Office of Science User Facility (ID proposta: CNMS2019-103 e CNMS2022-A-1182). Il supporto del CNMS viene assegnato attraverso un sistema di proposte sottoposto a revisione paritaria ed è fornito gratuitamente ai candidati selezionati che intendono pubblicare i loro risultati (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). Ringraziamo Kevin Lester e CNMS per l'assistenza nella produzione di array di nanofibre. Ringraziamo il Dr. John Caughmen, il Dr. Timothy McKnight, la Dr. Amber Webb, Daryl Briggs e Travis Bee per le discussioni critiche sul disegno sperimentale. Ringraziamo il Dr. Adam Rondinone per lo schema della macchina PECVD. Ringraziamo Leslie Carol per le illustrazioni scientifiche. Questo lavoro è stato finanziato dal Bioimaging Science Program, dal Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti, dall'Office of Science, Biological and Environmental Research, DE-SC0019104 e dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti, 2021-67013-34835. JMM è stato supportato dal Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti: National Institute of Food and Agriculture: Agriculture and Food Research Initiative Predoctoral Fellowship 2021-67034-35167.

1. Produzione di VACNF (Figura 2 e Figura 3)
<ol><li>Centrifugare un wafer di silicio con polimetilmetacrilato (PMMA) 495 A4 resist a 4000 giri/min e cuocerlo a 180 °C per 5 min. NOTA: Lasciare raffreddare il wafer per 10 s prima di procedere al passaggio successivo.</li>
	<li>Stendere un secondo strato di resist (PMMA 950 A2) e infornare a 180 °C per 5 min.</li>
	<li>Utilizzare la litografia a fascio di elettroni per definire i punti del catalizzatore con diametri di 300 nm a una spaziatura laterale specificata (passo: 10 μm o 35 μm) in array di 3 x 3 mm.</li>
	<li>Sviluppare il resist in 30-40 mL di metil-isobutilchetone 1:3: alcool isopropilico (IPA) per 1,5 minuti, quindi risciacquare con IPA e asciugare con N2. NOTA: Verificare la presenza della matrice di punti utilizzando un microscopio in campo chiaro (obiettivo 20x).</li>
	<li>Pulire il wafer del resist residuo con un'esposizione di 6 s in plasma di ossigeno (descum) in un incisore di silicio.</li>
	<li>Utilizzare l'evaporazione a fascio di elettroni per depositare prima uno strato adesivo di metallo (Ti o Cr, 10 nm) e poi depositare un secondo strato, che è il catalizzatore Ni (130 nm o 150 nm). Durante la deposizione di metalli Ti o Ni, mantenere la corrente al di sotto di 0,2 A a 10 kV, la pressione al di sotto di 5 x 10-6 Torr e la velocità di deposizione a ~1 A/s per la deposizione in linea di vista.</li>
	<li>Utilizzare la sonicazione sequenziale a bagno per rimuovere il metallo (Ni) depositato sullo strato di resist sottostante, lasciando il Ni depositato direttamente sul wafer di silicio. Questo processo è chiamato lift-off.<ol><li>Per questo, preparare 3 contenitori con acetone e bagnomarica sonicare il wafer in acetone per 1 min; ripetere 3 volte a temperatura ambiente (RT, 20 °C) alla frequenza di 35 kHz. Risciacquare con alcool isopropilico e asciugare con N2. NOTA: Non lasciare mai asciugare l'acetone sul wafer. Dopo l'ultima sonicazione con acetone, risciacquare immediatamente con alcool isopropilico e poi asciugare con gas N2 . Se in qualsiasi momento il wafer si asciuga prematuramente (prima del risciacquo con IPA) c'è la possibilità che non tutto il metallo in eccesso e il resist vengano rimossi e l'acetone possa lasciare un residuo.</li>
	</ol></li>
	<li>Controllare la geometria della forma del catalizzatore utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM). Per acquisire immagini SEM dei chip VACNF, inclinare il tavolino a un angolo di 30° e utilizzare una tensione di 1-3 kV, con una corrente del fascio di ~100 pA e una distanza di lavoro di ~5 mm. NOTA: Il catalizzatore dovrebbe assomigliare a un disco da hockey (un cilindro compatto) (Figura 4). L'altezza del cilindro compatto dovrebbe riflettere lo spessore di Ni depositato sul wafer di silicio. Se il profilo del punto di Ni è alto e sembra essere concavo nella parte superiore, simile a un vulcano (Figura 4), allora è più probabile che il catalizzatore si deumidichi in più goccioline di Ni con conseguente ramificazione delle nanofibre di carbonio9 (Figura 4 e Figura 5). Tali problemi possono derivare dalla fusione del resist durante l'evaporazione del metallo a causa dei lunghi tempi di deposizione o di problemi con la procedura di sollevamento (Figura 4 e Figura 5).</li>
	<li>Tagliare il wafer di silicio in un quarto e posizionarlo nella camera di deposizione chimica da vapore potenziata al plasma a corrente continua (dc-PECVD) con la miscela acetilene/ammoniaca. Ottimizzare i parametri di crescita per controllare la lunghezza e la conicità delle nanofibre (punte <200 nm).<ol><li>Utilizzare una corrente di 1-1,5 A e un intervallo di tensione di 440-560 V. Durante la crescita delle fibre, utilizzare una fase di pretrattamento con flusso di ammoniaca mentre la macchina e il substrato si riscaldano fino a 620 °C. Assicurarsi di accendere la fonte di carbone (acetilene) 10 s prima di avviare il plasma. NOTA: I quarti di wafer vengono utilizzati nel caso in cui sia necessario ottimizzare i parametri di funzionamento della macchina PECVD. Per produrre fibre con lunghezze superiori a 40 μm e punte di diametro inferiore a 200 nm, si consigliano i seguenti parametri: con uno spessore del catalizzatore Ni di 130 nm, utilizzare una corrente di 1,75 A, un tempo di crescita di 70 min e un rapporto acetilene / ammoniaca di 45 centimetri cubi standard al minuto (sccm) : 100 sccm. Con uno spessore di Ni di 150 nm, utilizzare una corrente di 1,5 A, un tempo di crescita di 80 min e un rapporto acetilene / ammoniaca di 48 sccm : 100 sccm. Utilizzare i seguenti parametri per far crescere i VACNF indipendentemente dallo spessore del catalizzatore: temperatura di crescita di 620 °C, pressione di 10 torr durante il plasma e altezza del soffione della doccia di 20 mm (Figura 6).</li>
	</ol></li>
	<li>Valutare la geometria delle fibre risultanti utilizzando SEM con un'inclinazione di 30° con un potenziale di accelerazione di 1 kV. NOTA: Le fibre ottimali saranno diritte e non ramificate. È impossibile controllare l'orientamento del cristallo del catalizzatore Ni con l'evaporatore a fascio di elettroni. Di conseguenza, ci saranno alcune fibre che si ramificano a causa della deumidificazione del catalizzatore9. Inoltre, l'orientamento dei cristalli fa sì che i VACNF crescano ad altezze diverse, quindi è difficile ottenere altezze uniformi su tutti i VACNF.</li>
	<li>Applicare uno strato di fotoresist (SPR955) sulle fibre a 1000 giri/min per 45 secondi. Quindi tagliare a dadini il wafer da 1/4 in matrici di 3 mm x 3 mm usando una sega a cubetti. Conservare le fibre a questo punto per un uso successivo. NOTA: Non eseguire il passaggio 1.11 se si prevede di trasferire le fibre su un substrato flessibile.</li>
</ol>2. Trasferimentodi VACNF su un substrato flessibile (Figura 7 e Figura 8)
<ol><li>Dopo che le fibre sono state sintetizzate, il fotoresist spincoat SU-8 2015 sui wafer o sui wafer a 4000 giri/min per 45 s.</li>
	<li>Cuocere il wafer per 3 minuti a 95 °C.</li>
	<li>Utilizzando un allineatore di contatto, esporre il wafer con una maschera di matrice da 3 mm e 3 mm che si allinea con il modello definito dalla litografia a fascio di elettroni a 95 mJ/cm2. NOTA: Utilizzare una modalità di contatto di prossimità con una distanza di esposizione di 20 μm maggiore della fibra più alta. C'è la possibilità che le fibre possano essere rovesciate durante questa fase del processo.</li>
	<li>Eseguire una cottura post-esposizione per 6 minuti a 95 °C.</li>
	<li>Sviluppare il wafer nel rivelatore SU-8 per 15 s, sciacquarlo con alcool isopropilico e asciugare il wafer con N2, muovendosi dall'alto verso il basso. NOTA: Quando si sviluppa il wafer, assicurarsi che sia completamente sommerso.</li>
	<li>Wafer a fantasia spincoat con uno strato protettivo di fotoresist sottile (SPR 955 CM 0,7) a 3000 giri/min per 45 s e softbake per 30 s a 90 °C.</li>
	<li>Depositare un sottile strato di ossido di silicio sul wafer (2-3 nm) ponendolo in uno strato atomico di deposizione per 22 cicli a 100 °C.</li>
	<li>Usa una sega a cubetti per tagliare il wafer in quadrati di 3 mm x 3 mm. Allineare la sega a cubetti al motivo preesistente sul wafer.</li>
	<li>Valutare la geometria delle fibre risultanti utilizzando SEM con un'inclinazione di 30° con un potenziale di accelerazione di 3 kV.</li>
	<li>Fermati qui se conservi le patatine per un uso a lungo termine (>1 settimana). Conserva le patatine al buio.</li>
	<li>Per separare i substrati flessibili da quelli rigidi, posizionare i singoli trucioli in acetone per 30 minuti o fino a quando il SU-8 inizia ad arricciarsi.</li>
	<li>Lavare le pellicole SU-8 (attaccate o staccate da substrati rigidi) con alcool isopropilico per 5 minuti e poi con acqua per 5 minuti. Metti le patatine in una scatola commerciale con un tampone adesivo durante il trasporto.</li>
	<li>OPZIONALE: Posizionare il lato senza fibre del film SU-8 su nastro solubile in acqua o sopra una sottile gomma siliconica con un sottile supporto in polietilene tereftalato (PET) (12.5 μm di spessore).<ol><li>Usa un paio di pinzette per trasferire la pellicola SU-8. Premere sui bordi del quadrato SU-8 per aiutarlo ad aderire al nastro/gomma siliconica-PET; Questo per evitare di rompere le fibre. A questo punto, le pellicole VACNF sono pronte per l'uso immediato.</li>
		<li>Per preparare un supporto in gomma siliconica/PET, procedere come segue: utilizzando un kit di 2 parti per gomma siliconica, mescolare le due parti insieme (l'elastomero e il reticolante). Quindi, ritaglia un quadrato di PET e fissalo con del nastro adesivo in un piatto di plastica trasparente. Versare uno strato molto sottile di gomma siliconica sopra il PET e polimerizzarlo a 80 °C per 1-2 ore.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Metodo su pianta (in cui una goccia di soluzione da erogare viene posizionata su una superficie della pianta) utilizzando fibre in un substrato rigido (Figura 1A)
<ol><li>Rimuovere il fotoresist con lavaggi incrementali di acetone (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) e ddH2O (5 min) prima dell'uso.</li>
	<li>Posizionare il tessuto vegetale da impalare su una superficie dura per il supporto.</li>
	<li>Posizionare una gocciolina di 1 μL di colorante o DNA (200 ng) sulla superficie del tessuto vegetale.</li>
	<li>Posizionare un chip VACNF con un substrato rigido sulla parte superiore della gocciolina, con le fibre orientate in modo tale che entrino in contatto con la gocciolina. NOTA: L'orientamento dei trucioli può essere determinato dalla "lucentezza" del wafer. Il lato lucido del chip ha fibre e il lato opaco no.</li>
	<li>Usando il lato piatto di un paio di pinzette, tocca il chip. Segna l'area della pianta con cui il truciolo è entrato in contatto utilizzando un pennarello a punta morbida. Rimuovere i chip VACNF dopo la consegna. NOTA: La quantità di forza applicata durante la picchiettatura varia a seconda del tipo di tessuto vegetale utilizzato. Si consiglia di esercitarsi a picchiettare i trucioli prima di eseguire l'impalamento delle fibre. Evitare danni ai tessuti vegetali. Il danno è evidente quando si può vedere il contorno del chip VACNF nel tessuto vegetale.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.1 a 3.5 per i controlli (+Colorante/DNA, -Fibre; -Colorante/DNA, +Fibre; e -Colorante/DNA, -Fibre). -Le fibre sono il lato senza fibre di un chip.</li>
	<li>Se necessario, conservare le piante intatte o gli organi vegetali asportati in camere umide in condizioni di lunga giornata (16 ore di luce, 8 ore di buio). Per gli organi asportati, utilizzare una capsula di Petri di plastica con carta assorbente bagnata.</li>
</ol>4. Metodo su chip (in cui una goccia di soluzione da erogare viene posizionata su un chip VACNF), substrato rigido (Figura 1B)
<ol><li>Rimuovere il fotoresist con lavaggi incrementali di acetone (100%, 5 min), IPA (100%, 5 min) e ddH2O (5 min) prima dell'uso.</li>
	<li>Far cadere una goccia di 1 μL di colorante o DNA plasmidico (200 ng) sul lato della fibra del chip VACNF con substrato rigido. Assicurati di posizionare la gocciolina al centro del chip e di coprire diverse fibre. Lasciare asciugare la goccia per 15 min. NOTA: L'orientamento dei trucioli può essere determinato dalla "lucentezza" del wafer. Il lato lucido del chip ha fibre e il lato opaco no.</li>
	<li>Quando si lavora con foglie o altri organi asportati, posizionarli sopra una superficie dura. Quando si lavora con piante intatte, posizionare una superficie dura sotto l'organo su cui vengono applicati i VACNF.</li>
	<li>Dopo la fase di asciugatura di 15 minuti, posizionare il chip VACNF in modo che il lato della fibra entri in contatto con il tessuto vegetale. Picchietta il chip con l'estremità posteriore di un paio di pinzette. NOTA: La quantità di forza applicata durante la picchiettatura varia a seconda del tipo di tessuto vegetale utilizzato. Si consiglia di esercitarsi a spillare i trucioli.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.6-3.7 del metodo in pianta.</li>
</ol>5. Applicazione di VACNF in film SU-8 al tessuto vegetale utilizzando il metodo on-chip (Figura 1C)
<ol><li>Posizionare 1 μL di gocciolina di colorante o DNA (200 ng) sul lato in fibra del film SU-8 e lasciarlo asciugare per 10 minuti. Assicurati di posizionare la goccia al centro del chip. NOTA: Ci sono tempi di asciugatura diversi a seconda del substrato utilizzato.</li>
	<li>Usando un paio di pinzette affilate, posiziona la pellicola VACNF sulla superficie della pianta. NOTA: Più a lungo le pellicole SU-8 vengono lasciate in aria, più fragili diventano le pellicole. Per limitare il rischio di perdere le pellicole SU-8, assicurarsi di avere tutti gli impianti/campioni e le attrezzature vicino alle pellicole SU-8.</li>
	<li>Stendere delicatamente un piccolo applicatore per il trucco sulla pellicola VACNF. Contrassegnare le aree in cui sono posizionati i substrati flessibili con un pennarello a punta morbida. Rimuovere i substrati flessibili dalla superficie della pianta utilizzando del nastro adesivo. NOTA: La quantità di forza applicata quando si arrotola l'applicatore per il trucco varia a seconda dei tessuti vegetali utilizzati. Esercitarsi ad applicare i film VACNF prima di eseguire la somministrazione di biomolecole o coloranti. Il danno visibile ai tessuti vegetali è evidente quando si possono vedere i contorni del film VACNF nel tessuto vegetale.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 5.1 a 5.3 per i controlli e conservare le piante come indicato al punto 3.7 del metodo in loco.</li>
</ol>6. Microscopia e analisi delle immagini per tutti i metodi di somministrazione
<ol><li>Visualizzare i campioni utilizzando un microscopio confocale utilizzando lunghezze d'onda di emissione ed eccitazione adatte alla sonda/reporter fluorescente fornita. NOTA: Il tempo necessario per la trasformazione transitoria varia a seconda della specie vegetale e del marcatore erogato. Ad esempio, l'espressione di marcatori fluorescenti è stata rilevata dopo 48 ore in Arabidopsis rispetto a 96 ore nelle foglie di lattuga7.</li>
	<li>Durante l'imaging, cerca di concentrarti su una regione con fibre staccate. Le fibre avranno orientamenti diversi. Il successo della consegna non dipende dalla comparsa di fibre spezzate. NOTA: Le fibre saranno fluorescenti con le impostazioni di eccitazione/emissione più comuni a causa della formazione di uno strato di nitruro di silicio derivante dalla formazione di fibre in PECVD18.</li>
	<li>Cattura almeno 5 immagini per ogni campione. Il segnale risultante varierà.</li>
	<li>Misurare i valori di fluorescenza come fluorescenza totale (densità integrata) in aree di immagine confocali20 μm x 20 μm 7 utilizzando ImageJ19.</li>
</ol>

Utilizzo di array di nanofibre di carbonio per un'efficiente somministrazione di biomolecole e coloranti alle piante

<ol>
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K., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+control+of+catalyst+nanoparticles+for+the+synthesis+of+high+density+carbon+nanofiber+arrays.">Positional control of catalyst nanoparticles for the synthesis of high density carbon nanofiber arrays.</a> Carbon. 46 (11), 1378-1383 (2008).</li><li>Rooks, M. J., Wind, S., McEuen, P., Prober, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+30-nm-scale+structures+for+electron+transport+studies+using+a+polymethylmethacrylate+bilayer+resist.">Fabrication of 30-nm-scale structures for electron transport studies using a polymethylmethacrylate bilayer resist.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B: Microelectronics Processing and Phenomena. 5 (1), 318-321 (1987).</li><li>Lee, G., Sohn, D. K., Seok, S. H., Ko, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hole+density+variation+in+the+PECVD+reactor+showerhead+on+the+deposition+of+amorphous+carbon+layer.">The effect of hole density variation in the PECVD reactor showerhead on the deposition of amorphous carbon layer.</a> Vacuum. 163, 37-44 (2019).</li><li>Fowlkes, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+catalyst+particle+crystallographic+orientation+in+vertically+aligned+carbon+nanofiber+synthesis.">Control of catalyst particle crystallographic orientation in vertically aligned carbon nanofiber synthesis.</a> Carbon. 44 (8), 1503-1510 (2006).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo documento, abbiamo presentato metodi per la costruzione di array di nanofibre di carbonio allineati verticalmente, trasferendo le fibre su un substrato flessibile e applicando fibre in un substrato rigido o flessibile alle piante per l'uso nella consegna di biomolecole o coloranti alle piante. Sono stati descritti due approcci generali, il metodo on-chip e il metodo on-plant, per la deposizione dei materiali introdotti e abbiamo mostrato risultati positivi nelle fibre su un substrato rigido, nonché il metodo on-chip utilizzando film VACNF. L'applicazione di queste fibre è più semplice nella pratica e nella teoria rispetto ai metodi tradizionali di trasformazione delle piante (bombardamento di particelle, trasformazione dei protoplasti tramite PEG o elettroporazione) e può essere utilizzata per piante recalcitranti alla trasformazione mediata da Agrobacterium. Tuttavia, solo poche cellule vengono trasformate.
Le nanofibre di carbonio allineate verticalmente sono state prodotte presso l'Oak Ridge National Laboratory Center for Nanophase Materials Sciences attraverso il loro programma utente. Gli utenti possono richiedere l'utilizzo di questa struttura per la produzione di VACNF. In alternativa, i chip VACNF possono essere prodotti in camere bianche con macchine per la deposizione chimica da vapore potenziate al plasma a corrente continua con una fonte di carbonio22,23. Con i metodi descritti, ci sono alcuni passaggi che sono fondamentali per la produzione delle fibre, il trasferimento delle fibre e l'applicazione dei chip/film VACNF. Affinché l'applicazione delle fibre funzioni, le fibre devono essere diritte e avere un diametro di rastremazione di <200 nm sulla punta affinché la somministrazione nelle cellule vegetali abbia successo 6,7 (Figura 3). Per creare nanofibre di carbonio di dimensioni e passo particolari, ci sono una varietà di parametri che possono essere modificati, tra cui la dimensione del punto, il passo laterale e la quantità di catalizzatore depositato. Per selezionare la dimensione ottimale del punto da utilizzare per la produzione di nanofibre di carbonio, le fibre sono state coltivate da varie dimensioni del punto (come mostrato nella Figura 5). Abbiamo scoperto che diametri di 300 nm producevano le fibre migliori, quindi è stata selezionata questa dimensione del punto (Figura 5). Dopo aver trovato i parametri giusti, abbiamo cercato di utilizzare chip che avessero il >50% di fibre con la geometria ideale (dritta e un diametro della punta <200 nm). Per verificare la geometria delle fibre, abbiamo utilizzato la microscopia elettronica a scansione per visualizzare campi visivi casuali su un campione di chip/pellicole VACNF.
Inoltre, le fibre devono avere una certa lunghezza minima per ottenere la consegna all'interno delle cellule vegetali. L'importanza di produrre fibre di diversa lunghezza è che le fibre più lunghe potrebbero essere utilizzate per penetrare negli strati di tessuto più profondi. Le fibre più lunghe (>40 μm di lunghezza) sono essenziali per i film flessibili poiché il trasferimento di fibre funziona rompendo le fibre dalla loro base e richiede la stratificazione di SU-8 sopra le fibre. Lo spessore di lavoro dello strato di SU-8 utilizzato per questo protocollo è di 20-35 μm. L'altezza minima necessaria per realizzare il parto all'interno dell'epidermide di varie piante (curva o piatta) è di 10-15 μm 6,7. Di conseguenza, per i film VACNF sono necessarie fibre con lunghezze >40 μm. Ci sono diversi parametri da considerare quando si producono nanofibre di carbonio: materiale del catalizzatore, geometria del catalizzatore, spessore del materiale del catalizzatore e condizioni all'interno della camera PECVD (rapporto del gas, pressione, temperatura, corrente, altezza del soffione e tempo di crescita)8,9,24,25. Per produrre nanofibre di carbonio più lunghe di 25 μm utilizzate da Morgan et al.7 e Davern et al.6, abbiamo aumentato la quantità di catalizzatore Ni, alterato il rapporto acetilene / ammoniaca e aumentato la corrente e il tempo di crescita. Inoltre, abbiamo prestato maggiore attenzione alla geometria del materiale del catalizzatore. Per produrre fibre alte e diritte, il catalizzatore depositato doveva avere la forma di un disco da hockey piuttosto che una forma che assomigliasse a un vulcano (Figura 4). Le strutture vulcaniche sorgono dai resti di fotoresist dopo il decollo. Per prevenire la formazione di vulcani, è stato utilizzato un doppio strato di PMMA per creare un sottosquadro durante la litografia a fascio di elettroni26. Il sottosquadro facilita il sollevamento del catalizzatore metallico depositato (Figura 2). Lo spesso strato del catalizzatore è importante per la crescita di VACNF alti. La morfologia dei VACNF è stata esaminata da Merkulova et al.24. L'allineamento verticale dei VACNF è dovuto sia alla crescita della punta del catalizzatore di Ni che agli allineamenti del potenziale CC perpendicolare al substrato (Figura 6). Il soffione descrive la geometria del reattore PECVD (Figura 6) e funge da sorgente per il potenziale del campo elettrico27.
Per definire l'array di punti catalizzatori con la litografia a fascio di elettroni, abbiamo applicato un resist a fascio di elettroni (polimetilmetacrilato), quindi abbiamo utilizzato l'e-beam per fare piccoli fori nel resist con una forma specifica e in punti specifici sul wafer. I fori del diametro desiderato sono stati posizionati su una griglia regolare con la spaziatura definita (passo) e un file che specifica il modello desiderato è stato caricato nello strumento di litografia a fascio di elettroni prima di caricare il substrato nella macchina. Oltre all'altezza della fibra, un altro parametro critico per il successo del trasferimento delle fibre è la quantità di tempo trascorso nel bagno di acetone. I film VACNF devono essere lasciati nel bagno di acetone abbastanza a lungo da far sì che i loro bordi inizino ad arricciarsi; Se vengono lasciati nel bagno di acetone per troppo poco tempo, è più difficile sollevare i trucioli e possono rompersi. Più vecchi sono i trucioli, più a lungo dovranno rimanere nel bagno di acetone. Dopo il bagno di acetone, i film/chip sono stati posti in isopropanolo e acqua per rimuovere l'acetone di accesso e per rimuovere il fotoresist protettivo sulle fibre.
Per eseguire lo spin coating, i wafer o i pezzi di wafer vengono posizionati su un mandrino a vuoto nella spin coater e la posizione centrale del wafer viene verificata utilizzando la funzione di test della spin coater. Una piccola pozzanghera (~2,5 cm di diametro) di resist viene applicata al centro del wafer e filata (3000 giri/min per 45 s) Le immagini delle fibre prima e dopo il rivestimento di rotazione sono incluse nella Figura 8 che mostra la conservazione della geometria delle fibre (altezza, orientamento e passo). La presenza di fibre fa sì che la resistenza si accumuli alla base delle fibre e si traduce in strati più spessi del previsto. Lo spin-coating dopo la crescita di VACNF è stato esplorato da altri gruppi11,18.
Un altro passo all'interno del processo che è di vitale importanza è garantire che venga applicata la giusta quantità di forza ai chip/film VACNF. Il meccanismo di rilascio dipende dal fatto che le fibre effettuino piccole perforazioni nelle pareti cellulari tramite la forza d'impulso della pinzetta che picchietta su substrati rigidi 6,7 o che rotola con il mini-applicatore di trucco su substrati flessibili. Le fibre possono o meno rompersi e rimanere incorporate nelle cellule vegetali6,7 senza alcun impatto sul risultato, ma la pratica in combinazione con l'esame per l'assorbimento del colorante e il danno tissutale è necessaria per ottenere la giusta pressione. Inoltre, è importante scegliere i punti temporali di imaging appropriati dopo la somministrazione del DNA con chip/pellicole VACNF, poiché il tempo di espressione rilevabile varia a seconda delle specie vegetali e dei tipi di vettori che vengono rilasciati7 (Figura 16).
Per quanto questo metodo sia ampiamente applicabile alle piante, presenta alcune limitazioni. Ad esempio, l'aggiunta di un sottile strato di ossido di silicio alle pellicole VACNF non sempre comporta che le pellicole siano completamente idrofile a causa dello strato protettivo di fotoresist aggiunto sulla parte superiore del SU-8. Se questo problema si materializza, strati più spessi di ossido di silicio potrebbero essere applicati ai VACNF. Per verificare se le pellicole sono idrofobiche o idrofile, possono essere messe in acqua. Se le pellicole affondano, sono idrofile, e se galleggiano, sono idrofobiche. Inoltre, ci possono essere variazioni tra i lotti di fibre prodotte. Ci sono diversi parametri che possono essere alterati quando si coltivano le fibre nella macchina dc-PECVD; ciò che viene descritto in questo protocollo è un insieme di parametri per due diverse quantità di catalizzatore Ni. Inoltre, l'orientamento del cristallo del catalizzatore Ni non può essere controllato28 e alcune ramificazioni si tradurranno inevitabilmente nelle fibre.
Mentre abbiamo dimostrato la somministrazione di colorante fluoresceina e DNA alle cellule vegetali utilizzando substrati sia rigidi che flessibili, il metodo dovrebbe essere ampiamente applicabile ad altre biomolecole e approcci di modificazione genetica, ad esempio, il silenziamento dell'RNAi per sistemi vegetali come mele o altri frutti in cui ci vorrebbero anni per produrre linee transgeniche stabili. Inoltre, queste fibre potrebbero anche essere utilizzate per fornire materiali di editing genetico o per trasformazioni stabili nelle piante.

La trasformazione delle piante (sia transitorie che stabili) deve ancora diventare ampiamente realizzabile in tutti i tessuti e le specie vegetali. La trasformazione transitoria delle piante è un processo mediante il quale i geni codificati nei plasmidi vengono temporaneamente introdotti nelle piante ma non vengono incorporati stabilmente nel genoma. I metodi tradizionali che utilizzano il bombardamento di particelle, gli agrobatteri, l'elettroporazione o il trattamento con glicole polietilenico dei protoplasti sono lenti o possono essere ingombranti. Inoltre, non sono applicabili a tutte le specie vegetali 1,2,3,4. L'uso di nanomateriali per la somministrazione del DNA è un campo fiorente che è ancora agli inizi5. Anche i nanomateriali, in particolare le nanofibre di carbonio, sono stati utilizzati con successo per fornire proteine, destrani e coloranti alle foglie delle piante senza causare la risposta della ferita6. L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo dettagliato per l'utilizzo di un tipo di nanomateriale, le nanofibre di carbonio, per la somministrazione di biomolecole o coloranti alle piante. Qui, ci concentriamo sul DNA come biomolecola di scelta, che consente la trasformazione transitoria delle cellule in vari organi vegetali.
In precedenza, Morgan et al.7 hanno dimostrato l'uso di nanofibre di carbonio fissate a substrati rigidi di silicio per trasformare transitoriamente foglie di lattuga, N. benthamiana e pioppo, e sia foglie che radici di Arabidopsis. Sebbene le trasformazioni abbiano avuto successo su una varietà di organi, le fibre sono risultate più difficili da applicare ai tessuti vegetali con superfici curve, come radici o frutti. Abbiamo ragionato sul fatto che un supporto flessibile per le nanofibre potrebbe migliorare la loro efficienza di rilascio conformandosi meglio alla forma dell'organo.
In questo articolo, descriviamo in dettaglio i metodi utilizzati per la fabbricazione e la progettazione di nanofibre di carbonio allineate verticalmente, il trasferimento di VACNF su substrati flessibili e l'applicazione di VACNF su substrati rigidi e flessibili alle piante per fornire biomolecole e coloranti. Le nanofibre di carbonio sono state prodotte utilizzando la deposizione chimica da vapore potenziata da plasma catalitico a corrente continua (dc C-PECVD) con catalizzatore di Ni. La posizione, il diametro e l'altezza dei punti del catalizzatore di Ni sono stati controllati utilizzando una combinazione di litografia a fascio di elettroni, evaporazione del metallo e processi di lift-off come descritto da Melechko et al.8,9. Utilizzando un e-beam resist a doppio strato, un catalizzatore di Ni più spesso può essere depositato sul substrato per ottenere fibre più lunghe10. Il trasferimento di fibre da un substrato rigido a uno flessibile si basa su una modifica dei metodi descritti in Fletcher et al.11, con i metodi attuali che rinunciano all'uso di uno strato di carbonio amorfo o di uno strato di fotoresist sacrificale. Il decollo di SU-8 con trasferimento di fibre si ottiene utilizzando la sollecitazione di trazione intrinseca derivante dalla sottocottura e dalla sottoesposizione del SU-812,13,14. SU-8, un polimero complesso, è naturalmente idrofobo, il che rende difficile il suo utilizzo per facilitare la consegna del DNA. Per contrastare la natura idrofobica del SU-8, applichiamo un sottile strato di ossido di silicio tramite la deposizione dello strato atomico15 dopo che le fibre sono state incorporate nel SU-8. L'applicazione di fibre su un substrato rigido per la somministrazione di biomolecole/coloranti utilizza la forza d'impatto della maschiatura con pinzette descritta in Davern et al.6 e i metodi on-plant e on-chip descritti in Morgan et al.7. I film VACNF flessibili vengono applicati su superfici vegetali curve mediante prima semiessiccazione di DNA o goccioline di colorante sul film come con il metodo on-chip di Morgan et al.7e poi arrotolando i film su superfici vegetali curve utilizzando un piccolo applicatore di trucco16,17. La Figura 1 illustra vari approcci per l'applicazione di fibre in substrati rigidi e flessibili alle piante.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13&#34; x 13&#34; White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct</td>
			<td>Fastenal&#160;</td>
			<td>690535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol (IPA)&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Lid</td>
			<td>Entegris</td>
			<td>H22-401-0615</td>
			<td>Wafer Carriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; tray</td>
			<td>Entegris</td>
			<td>H22-40-0615</td>
			<td>Wafer Carriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accretech SS10 dicing saw</td>
			<td>Accreteck</td>
			<td>SS10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone used in the cleanroom at ORNL</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9005-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apples</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana&#160;</td>
			<td>Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine</td>
			<td>Oak Ridge National Laboratory&#160;</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobham Green lettuce&#160;</td>
			<td>Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis</td>
			<td>No product number</td>
			<td>Butterhead lettuce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein dye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2456-2.5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-box&#160;</td>
			<td>Gel-Pak</td>
			<td>&#160;AD-23C-00-X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool&#160;</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>DWL 66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institues of Health&#160;</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL</td>
			<td>Doe and Ingalls</td>
			<td>CMOS Grade 9079-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional 34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11019-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor&#160;</td>
			<td>&#160;juspertor GmbH</td>
			<td>No product number&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Make-up applicator&#160;</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>G2PLUS</td>
			<td>500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merlin field emission scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Merlin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIBK/IPA&#160; (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3)</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M089025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Onions</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford FlexAl atomic layer deposition</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>FlexAl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 495 A4</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M130004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 950 A4</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M230004</td>
			<td>Can dilute down to A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>KS-6304-21-11</td>
			<td>Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005&#34; Thick x 27&#34; Width x 10 Ft Length 1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers</td>
			<td>Aven Inc.&#160;</td>
			<td>18032TT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUBQ10:YFP-GW</td>
			<td>Arabidopsis Biological Resource Center</td>
			<td>CD3-1948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon etcher (used for descum)&#160;</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>Plasmalab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rubber kit</td>
			<td>Smooth-On Inc</td>
			<td>Ecoflex 00-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Pure Wafer</td>
			<td>4N0.001-.005SSP-INV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Brewer Sciences</td>
			<td>Model 100CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR 955cm 0.7&#160;</td>
			<td>Megaposit</td>
			<td>10018314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strawberries</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2015</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 Series</td>
			<td>Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 Series</td>
			<td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suss MicroTec contact aligner</td>
			<td>Suss MicroTec</td>
			<td>MA6/BA6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top microscope</td>
			<td>Phenom XL</td>
			<td>used for checking Ni catalysts after metal deposition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermionics VE-240 e-beam evaporator</td>
			<td>Thermionics</td>
			<td>VE-240</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using vertically aligned carbon nanofiber arrays on rigid or flexible substrates for delivery of biomolecules and dyes to plants

La somministrazione di biomolecole e coloranti impermeabili alle piante intatte è una sfida importante. I nanomateriali sono strumenti emergenti per la consegna del DNA alle piante. Per quanto entusiasmanti siano questi nuovi strumenti, devono ancora essere ampiamente applicati. I nanomateriali fabbricati su substrato rigido (supporto) sono particolarmente difficili da applicare con successo a strutture vegetali curve. Questo studio descrive il processo per la microfabbricazione di array di nanofibre di carbonio allineati verticalmente e il loro trasferimento da un substrato rigido a uno flessibile. Descriviamo in dettaglio e dimostriamo come queste fibre (su substrati rigidi o flessibili) possono essere utilizzate per la trasformazione transitoria o per la somministrazione di coloranti (ad esempio, fluoresceina) alle piante. Mostriamo come i VACNF possono essere trasferiti da un substrato di silicio rigido a un substrato epossidico flessibile SU-8 per formare array VACNF flessibili. Per superare la natura idrofobica del SU-8, le fibre del film flessibile sono state rivestite con un sottile strato di ossido di silicio (2-3 nm). Per utilizzare queste fibre per la somministrazione agli organi vegetali curvi, depositiamo una gocciolina di 1 μL di colorante o soluzione di DNA sul lato della fibra delle pellicole VACNF, attendiamo 10 minuti, posizioniamo le pellicole sull'organo vegetale e impieghiamo un tampone con un movimento rotatorio per guidare le fibre nelle cellule vegetali. Con questo metodo, abbiamo ottenuto la somministrazione di coloranti e DNA in organi vegetali con superfici curve.

Plant transformation (both transient and stable) has yet to become widely achievable in all plant tissues and species. The transient transformation of plants is a process by which genes encoded in plasmids are temporarily introduced into plants but are not stably incorporated into the genome. Traditional methods that use particle bombardment, Agrobacteria, electroporation, or polyethylene glycol treatment of protoplasts are slow or can be cumbersome. Furthermore, they are not applicable to every plant species1,2,3,4.&#160;The use of nanomaterials for DNA delivery is a burgeoning field that is still in its infancy5. Nanomaterials, specifically carbon nanofibers have also successfully been used to deliver proteins, dextrans and dyes to plant leaves without causing wound response6. The goal of this work is to provide a detailed protocol for using one type of nanomaterial, carbon nanofibers, for delivering biomolecules or dyes to plants. Here, we focus on DNA as the biomolecule of choice, which permits the transient transformation of cells in various plant organs.
Previously, Morgan et al.7 demonstrated the use of carbon nanofibers affixed to rigid silicon substrate to transiently transform leaves of lettuce, N. benthamiana, and poplar, and both leaves and roots of Arabidopsis. Although transformations were successful on a variety of organs, fibers were more difficult to apply to plant tissues with curved surfaces, such as roots or fruits. We reasoned that a flexible backing for nanofibers might improve their efficiency of delivery by conforming better to the shape of the organ.
Herein, we detail methods utilized for fabricating and designing vertically aligned carbon nanofibers, transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants to deliver biomolecules and dyes. Carbon nanofibers were produced using direct current catalytic plasma-enhanced chemical vapor deposition (dc C-PECVD) with Ni catalyst. The position, diameter, and height of Ni catalyst dots were controlled using a combination of electron beam lithography, metal evaporation, and lift-off processes as described by Melechko et al.8,9. Using a double-layer e-beam resist, a thicker Ni catalyst can be deposited on the substrate to give longer fibers10. Fiber transfer from a rigid to a flexible substrate is based on a modification of methods described in Fletcher et al.11, with the current methods foregoing the use of an amorphous carbon layer or a sacrificial photoresist layer. SU-8 lift-off with fiber transfer is achieved by utilizing the intrinsic tensile stress resulting from underbaking and underexposing the SU-812,13,14. SU-8, a complex polymer, is naturally hydrophobic, which makes its use for facilitating DNA delivery difficult. To counteract the hydrophobic nature of SU-8, we apply a thin layer of silicon oxide via atomic layer deposition15 after fibers are embedded in SU-8. Application of fibers on a rigid substrate for biomolecule/dye delivery utilizes the impact force of tweezer tapping described in Davern et al.6 and the on-plant and on-chip methods described in Morgan et al.7. Flexible VACNF films are applied to curved plant surfaces by first semidrying DNA or dye droplets on the film as with the on-chip method from Morgan et al.7and then rolling the films on curved plant surfaces using a small makeup applicator16,17. Figure 1 depicts various approaches for applying fibers in rigid and flexible substrates to plants.

Autore in primo piano: Sbloccare la trasformazione delle piante innovando con gli array di nanofibre di carbonio 

Utilizzo di array di nanofibre di carbonio allineati verticalmente su substrati rigidi o flessibili per la somministrazione di biomolecole e coloranti alle piante

We are trying to demonstrate a general method for delivery of dye or DNA into plants using carbon nanofiber arrays. Many plants are recalcitrant to traditional transformation methods. Our method can solve this problem using carbon nanofiber arrays on flexible rigid substrates.Our technique is fast and user-friendly. It can be applied to virtually any plant species or plant organ. It can also be used to deliver other reagents such as dyes and proteins.

Watch this Scientific Journal Video about Unlocking Plant Transformation by Innovating with Carbon Nanofiber Arrays at JoVE.com

Qui descriviamo i metodi per la microfabbricazione di nanofibre di carbonio allineate verticalmente (VACNF), il trasferimento di VACNF su substrati flessibili e l'applicazione di VACNF su substrati rigidi e flessibili alle piante per la somministrazione di biomolecole e coloranti.

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to ...

Stiamo cercando di dimostrare un metodo generale per la somministrazione di coloranti o DNA nelle piante utilizzando array di nanofibre di carbonio. Molte piante sono recalcitranti ai metodi di trasformazione tradizionali. Il nostro metodo può risolvere questo problema utilizzando array di nanofibre di carbonio su substrati rigidi flessibili.La nostra tecnica è veloce e facile da usare. Può essere applicato praticamente a qualsiasi specie vegetale o organo vegetale. Può anche essere utilizzato per veicolare altri reagenti come coloranti e proteine.

Utilizzo di array di nanofibre di carbonio allineati verticalmente su substrati rigidi o flessibili per la somministrazione di biomolecole e coloranti alle piante

Abstract