Изучение фармакологического действия и молекулярного механизма салидрозида в ингибировании пролиферации и миграции клеток MCF-7

Summary

Настоящий протокол описывает комплексную стратегию оценки фармакологического действия и механизма салидрозида в ингибировании пролиферации и миграции клеток MCF-7.

Abstract

Салидрозид (Sal) обладает антиканцерогенной, антигипоксической и противовоспалительной фармакологической активностью. Тем не менее, лежащие в его основе механизмы борьбы с раком молочной железы были выяснены лишь до конца. Таким образом, этот протокол был направлен на расшифровку потенциала Sal в регуляции пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 в злокачественной пролиферации клеток MCF-7 рака молочной железы человека. Во-первых, фармакологическую активность Sal в отношении MCF-7 оценивали с помощью CCK-8 и клеточного скретч-анализа. Кроме того, резистентность клеток MCF-7 была измерена с помощью анализов миграции и инвазии Матригеля. Для клеточного апоптоза и циклических анализов клетки MCF-7 обрабатывали поэтапно с помощью аннексина V-FITC/PI и наборов для обнаружения окрашивания клеточного цикла для анализа проточной цитометрии, соответственно. Уровни активных форм кислорода (АФК) и^Ca2+ исследовали методом иммунофлуоресцентного окрашивания DCFH-DA и Fluo-4 AM. Активность Na+-K+-АТФазы и Ca2⁺-АТФазы определяли с помощью соответствующих коммерческих наборов. Уровни экспрессии белков и генов в апоптозе и пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 дополнительно определяли с помощью вестерн-блоттинга и qRT-ПЦР-анализа соответственно. Мы обнаружили, что лечение Sal значительно ограничивало пролиферацию, миграцию и инвазию клеток MCF-7 с дозозависимыми эффектами. Между тем, введение Sal также резко заставляло клетки MCF-7 подвергаться апоптозу и остановке клеточного цикла. Иммунофлуоресцентные тесты показали, что Sal наблюдаемо стимулирует продукцию АФК и^Ca2+ в клетках MCF-7. Дальнейшие данные подтвердили, что Sal способствовал уровню экспрессии проапоптотических белков, Bax, Bim, расщепленной каспазы-9/7/3 и соответствующих им генов. Последовательно вмешательство Sal заметно снижало экспрессию белков Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α и FoxO1 и соответствующих им генов. В заключение, Sal может быть использован в качестве потенциального растительного соединения для лечения рака молочной железы, поскольку он может уменьшить злокачественную пролиферацию, миграцию и инвазию клеток MCF-7 путем ингибирования пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

Introduction

Как один из наиболее часто диагностируемых видов рака и наиболее распространенных злокачественных новообразований, последние статистические данные показывают, что к 2020 году во всем мире возникло 2,3 миллиона случаев рака молочной железы, что составляет 11,7%^{всех случаев рака}. Общие симптомы рака молочной железы включают болезненность и покалывание в груди, уплотнения и боль в груди, выделения из сосков, эрозию или впалую кожу, а также увеличение подмышечных лимфатических узлов ^1,2. Еще большую тревогу вызывает тот факт, что число новых случаев заболевания и общая заболеваемость раком ....

Protocol

Клетки MCF-7, использованные в настоящем исследовании, были получены из коммерческого источника (см. таблицу материалов).

1. Клеточная культура

1. Культивирование клеток MCF-7 в увлажненной атмосфере 5% CO₂ при 37 °C с DMEM, содержащим 10% FBS и 1% пенициллина (1.......

Discussion

Рак молочной железы поражает людей всех возрастов и вызывает неисчислимое физическое и психическое бремя, а также большое экономическое давление¹. Рак молочной железы с его растущей заболеваемостью и смертностью с каждым годом также привлек внимание всего мира с точки зр?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin/streptomycin	HyClone	SV30010
AKT antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT0185
Annexin V-FITC/PI kit	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	AP101
Automatic microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax iD5
Bax antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#5023
BCA kit	Biosharp Life Sciences	BL521A
Bcl-2 antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#15071
Bim antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#2933
Ca2+–ATPase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A070-4-2
Cell counting kit-8	Biosharp Life Sciences	BS350B
Cell cycle staining kit	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	CCS012
cleaved caspase-3	Cell Signaling Technology, Inc.	#9661
cleaved caspase-7	Cell Signaling Technology, Inc.	#8438
cleaved caspase-9	Cell Signaling Technology, Inc.	#20750
Crystal violet solution	Beyotime Biotechnology	C0121
DMEM high glucose culture medium	Servicebio Technology Co., Ltd.	G4510
Doxorubicin hydrochloride	MedChemExpress	HY-15142
ECL chemiluminescent solution	Biosharp Life Sciences	BL520B
Fetal bovine serum	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	164210
Flow cytometer	BD	FACSCanto
Fluo-4 AM	Beyotime Biotechnology	S1060
FoxO1 antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	70-GAR0072
GraphPad Prism software	La Jolla	Version 6.0
HIF-1α antibody	Affinity Biosciences	BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	CL-0149
Loading buffer	Biosharp Life Sciences	BL502B
LY294002	MedChemExpress	HY-10108
Matrigel	Thermo	356234
mTOR antibody	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A070-2-2
Optical microscope	Olympus	IX71PH
p-AKT antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YP0006
PI3K antibody	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11525
p-PI3K antibody	Affinity Biosciences	AF3241
Quantitative western blot imaging system	Touch Image Pro	eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit	Servicebio Technology Co., Ltd.	G3330-100
ROS assay kit	Beyotime Biotechnology	S0033S	DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside	Chengdu Herbpurify Co., Ltd.	H-040
SDS-PAGE kit	Servicebio Technology Co., Ltd.	G2003-50T
Total RNA isolation kit	Foregene	RE-03014
Trypsin	HyClone	SH30042.01
β-actin	Affinity Biosciences	AF7018