A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Настоящий протокол описывает комплексную стратегию оценки фармакологического действия и механизма салидрозида в ингибировании пролиферации и миграции клеток MCF-7.
Салидрозид (Sal) обладает антиканцерогенной, антигипоксической и противовоспалительной фармакологической активностью. Тем не менее, лежащие в его основе механизмы борьбы с раком молочной железы были выяснены лишь до конца. Таким образом, этот протокол был направлен на расшифровку потенциала Sal в регуляции пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 в злокачественной пролиферации клеток MCF-7 рака молочной железы человека. Во-первых, фармакологическую активность Sal в отношении MCF-7 оценивали с помощью CCK-8 и клеточного скретч-анализа. Кроме того, резистентность клеток MCF-7 была измерена с помощью анализов миграции и инвазии Матригеля. Для клеточного апоптоза и циклических анализов клетки MCF-7 обрабатывали поэтапно с помощью аннексина V-FITC/PI и наборов для обнаружения окрашивания клеточного цикла для анализа проточной цитометрии, соответственно. Уровни активных форм кислорода (АФК) иCa2+ исследовали методом иммунофлуоресцентного окрашивания DCFH-DA и Fluo-4 AM. Активность Na+-K+-АТФазы и Ca2+-АТФазы определяли с помощью соответствующих коммерческих наборов. Уровни экспрессии белков и генов в апоптозе и пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 дополнительно определяли с помощью вестерн-блоттинга и qRT-ПЦР-анализа соответственно. Мы обнаружили, что лечение Sal значительно ограничивало пролиферацию, миграцию и инвазию клеток MCF-7 с дозозависимыми эффектами. Между тем, введение Sal также резко заставляло клетки MCF-7 подвергаться апоптозу и остановке клеточного цикла. Иммунофлуоресцентные тесты показали, что Sal наблюдаемо стимулирует продукцию АФК иCa2+ в клетках MCF-7. Дальнейшие данные подтвердили, что Sal способствовал уровню экспрессии проапоптотических белков, Bax, Bim, расщепленной каспазы-9/7/3 и соответствующих им генов. Последовательно вмешательство Sal заметно снижало экспрессию белков Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α и FoxO1 и соответствующих им генов. В заключение, Sal может быть использован в качестве потенциального растительного соединения для лечения рака молочной железы, поскольку он может уменьшить злокачественную пролиферацию, миграцию и инвазию клеток MCF-7 путем ингибирования пути PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.
Как один из наиболее часто диагностируемых видов рака и наиболее распространенных злокачественных новообразований, последние статистические данные показывают, что к 2020 году во всем мире возникло 2,3 миллиона случаев рака молочной железы, что составляет 11,7%всех случаев рака. Общие симптомы рака молочной железы включают болезненность и покалывание в груди, уплотнения и боль в груди, выделения из сосков, эрозию или впалую кожу, а также увеличение подмышечных лимфатических узлов 1,2. Еще большую тревогу вызывает тот факт, что число новых случаев заболевания и общая заболеваемость раком ....
Клетки MCF-7, использованные в настоящем исследовании, были получены из коммерческого источника (см. таблицу материалов).
1. Клеточная культура
Влияние Sal на ингибирование избыточной пролиферации и замедление заживления ран в клетках MCF-7
Чтобы исследовать потенциал Sal против рака молочной железы, мы сначала проверили его противоопухолевые свойства, используя токсичность пролиферации клеток и скретч-анализы клеточ?.......
Рак молочной железы поражает людей всех возрастов и вызывает неисчислимое физическое и психическое бремя, а также большое экономическое давление1. Рак молочной железы с его растущей заболеваемостью и смертностью с каждым годом также привлек внимание всего мира с точки зр?.......
Авторам нечего раскрывать.
Эта работа была поддержана Комиссией по здравоохранению провинции Сычуань (120025).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1% penicillin/streptomycin | HyClone | SV30010 | |
AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT0185 | |
Annexin V-FITC/PI kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | AP101 | |
Automatic microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
Bax antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #5023 | |
BCA kit | Biosharp Life Sciences | BL521A | |
Bcl-2 antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #15071 | |
Bim antibody | Cell Signaling Technology, Inc. | #2933 | |
Ca2+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-4-2 | |
Cell counting kit-8 | Biosharp Life Sciences | BS350B | |
Cell cycle staining kit | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | CCS012 | |
cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technology, Inc. | #9661 | |
cleaved caspase-7 | Cell Signaling Technology, Inc. | #8438 | |
cleaved caspase-9 | Cell Signaling Technology, Inc. | #20750 | |
Crystal violet solution | Beyotime Biotechnology | C0121 | |
DMEM high glucose culture medium | Servicebio Technology Co., Ltd. | G4510 | |
Doxorubicin hydrochloride | MedChemExpress | HY-15142 | |
ECL chemiluminescent solution | Biosharp Life Sciences | BL520B | |
Fetal bovine serum | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | 164210 | |
Flow cytometer | BD | FACSCanto | |
Fluo-4 AM | Beyotime Biotechnology | S1060 | |
FoxO1 antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YT1758 | |
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody | MultiSciences Biotech Co., Ltd. | 70-GAR0072 | |
GraphPad Prism software | La Jolla | Version 6.0 | |
HIF-1α antibody | Affinity Biosciences | BF8002 | |
Human breast cancer cell line MCF-7 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd. | CL-0149 | |
Loading buffer | Biosharp Life Sciences | BL502B | |
LY294002 | MedChemExpress | HY-10108 | |
Matrigel | Thermo | 356234 | |
mTOR antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11405 | |
Na+–K+–ATPase assay kit | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A070-2-2 | |
Optical microscope | Olympus | IX71PH | |
p-AKT antibody | ImmunoWay Biotechnology Company | YP0006 | |
PI3K antibody | Servicebio Technology Co., Ltd. | GB11525 | |
p-PI3K antibody | Affinity Biosciences | AF3241 | |
Quantitative western blot imaging system | Touch Image Pro | eBlot | |
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G3330-100 | |
ROS assay kit | Beyotime Biotechnology | S0033S | DCFH-DA fluorescence probe is included here |
Salidroside | Chengdu Herbpurify Co., Ltd. | H-040 | |
SDS-PAGE kit | Servicebio Technology Co., Ltd. | G2003-50T | |
Total RNA isolation kit | Foregene | RE-03014 | |
Trypsin | HyClone | SH30042.01 | |
β-actin | Affinity Biosciences | AF7018 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved