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Questo articolo descrive come biostampare in 3D idrogel fototabili per studiare l'irrigidimento della matrice extracellulare e l'attivazione dei fibroblasti.
Gli idrogel fototabili possono trasformarsi spazialmente e temporalmente in risposta all'esposizione alla luce. L'incorporazione di questi tipi di biomateriali nelle piattaforme di coltura cellulare e l'innesco dinamico dei cambiamenti, come l'aumento della rigidità microambientale, consente ai ricercatori di modellare i cambiamenti nella matrice extracellulare (ECM) che si verificano durante la progressione della malattia fibrotica. In questo articolo, viene presentato un metodo per la biostampa 3D di un biomateriale idrogel fototabile in grado di eseguire due reazioni di polimerizzazione sequenziale all'interno di un bagno di supporto di gelatina. La tecnica di bioprinting FRESH (Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels) è stata adattata regolando il pH del bagno di supporto per facilitare una reazione di addizione di Michael. In primo luogo, il bioink contenente poli(glicole etilenico)-alfa metacrilato (PEGαMA) è stato fatto reagire fuori stechiometria con un reticolante degradabile in cella per formare idrogel morbidi. Questi idrogel morbidi sono stati successivamente esposti al fotoinitatore e alla luce per indurre l'omopolimerizzazione di gruppi non reagiti e irrigidire l'idrogel. Questo protocollo copre la sintesi dell'idrogel, la biostampa 3D, il fotoirrigidimento e la caratterizzazione degli endpoint per valutare l'attivazione dei fibroblasti all'interno di strutture 3D. Il metodo qui presentato consente ai ricercatori di biostampare in 3D una varietà di materiali che subiscono reazioni di polimerizzazione catalizzate dal pH e potrebbe essere implementato per progettare vari modelli di omeostasi, malattia e riparazione dei tessuti.
La biostampa 3D è una tecnologia trasformativa che consente ai ricercatori di depositare con precisione cellule e biomateriali all'interno di volumi 3D e ricreare la complessa struttura gerarchica dei tessuti biologici. Nell'ultimo decennio, i progressi nella biostampa 3D hanno creato tessuti cardiaci umani1 battenti, modelli funzionali di tessuti renali2, modelli di scambio gassoso all'interno del polmone3 e modelli tumorali per la ricerca sul cancro4. L'invenzione di tecniche di bioprinting 3D embedded, come la bioprinting FRESH (Freeform Reversible Embedding of Suspended....
1. Sintesi e caratterizzazione di PEGαMA
NOTA: La sintesi del poli(glicole etilenico)-alfa metacrilato (PEGαMA) è stata adattata da Hewawasam et al . ed eseguita in condizioni di assenza di umidità9.
Questo protocollo descrive come biostampare in 3D idrogel fototabili all'interno di un bagno di supporto per creare costrutti in grado di irrigidirsi dinamici e temporali per studiare l'attivazione dei fibroblasti in geometrie che imitano i tessuti umani. In primo luogo, il protocollo ha spiegato come sintetizzare PEGαMA, la spina dorsale di questo sistema polimerico fototabile. Le misurazioni della spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) hanno mostrato una funzionalizzazione riuscita del PEGαMA al 96,5% (<.......
Le reazioni di polimerizzazione a doppio stadio in risposta all'esposizione controllata alla luce possono irrigidire i biomateriali con controllo spaziale e temporale. Diversi studi hanno sfruttato questa tecnica per valutare le interazioni cellula-matrice in varie piattaforme 5,8,9,10,11,21,22,23.
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare. Parti di questo manoscritto sono riprodotte con il permesso di © IOP Publishing https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf. 5 Tutti i diritti riservati.
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Adam Feinberg (Carnegie Mellon University) e coloro che hanno ospitato il 3D Bioprinting Open-Source Workshop. Queste persone hanno reso possibile l'apprendimento delle tecniche di bioprinting FRESH e la costruzione della biostampante 3D utilizzata per questi studi. Inoltre, gli autori vorrebbero riconoscere Biorender.com, che è stato utilizzato per produrre figure in questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da più gruppi o fonti di finanziamento, tra cui la Rose Community Foundation (DDH e CMM), un Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award (DDH e CMM), la National Science Foundation nell'ambito dell'Award 1....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA) | Ambeed Inc. | A918087-25g | Used during PEGaMA synthesis |
Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
Incubator | VWR | VWR51014991 | |
LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
Rocker | VWR | 10127-876 | |
Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
Rubber Band | Staples | 808659 | |
Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
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