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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Questo articolo descrive come biostampare in 3D idrogel fototabili per studiare l'irrigidimento della matrice extracellulare e l'attivazione dei fibroblasti.

Abstract

Gli idrogel fototabili possono trasformarsi spazialmente e temporalmente in risposta all'esposizione alla luce. L'incorporazione di questi tipi di biomateriali nelle piattaforme di coltura cellulare e l'innesco dinamico dei cambiamenti, come l'aumento della rigidità microambientale, consente ai ricercatori di modellare i cambiamenti nella matrice extracellulare (ECM) che si verificano durante la progressione della malattia fibrotica. In questo articolo, viene presentato un metodo per la biostampa 3D di un biomateriale idrogel fototabile in grado di eseguire due reazioni di polimerizzazione sequenziale all'interno di un bagno di supporto di gelatina. La tecnica di bioprinting FRESH (Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels) è stata adattata regolando il pH del bagno di supporto per facilitare una reazione di addizione di Michael. In primo luogo, il bioink contenente poli(glicole etilenico)-alfa metacrilato (PEGαMA) è stato fatto reagire fuori stechiometria con un reticolante degradabile in cella per formare idrogel morbidi. Questi idrogel morbidi sono stati successivamente esposti al fotoinitatore e alla luce per indurre l'omopolimerizzazione di gruppi non reagiti e irrigidire l'idrogel. Questo protocollo copre la sintesi dell'idrogel, la biostampa 3D, il fotoirrigidimento e la caratterizzazione degli endpoint per valutare l'attivazione dei fibroblasti all'interno di strutture 3D. Il metodo qui presentato consente ai ricercatori di biostampare in 3D una varietà di materiali che subiscono reazioni di polimerizzazione catalizzate dal pH e potrebbe essere implementato per progettare vari modelli di omeostasi, malattia e riparazione dei tessuti.

Introduction

La biostampa 3D è una tecnologia trasformativa che consente ai ricercatori di depositare con precisione cellule e biomateriali all'interno di volumi 3D e ricreare la complessa struttura gerarchica dei tessuti biologici. Nell'ultimo decennio, i progressi nella biostampa 3D hanno creato tessuti cardiaci umani1 battenti, modelli funzionali di tessuti renali2, modelli di scambio gassoso all'interno del polmone3 e modelli tumorali per la ricerca sul cancro4. L'invenzione di tecniche di bioprinting 3D embedded, come la bioprinting FRESH (Freeform Reversible Embedding of Suspended....

Protocol

1. Sintesi e caratterizzazione di PEGαMA

NOTA: La sintesi del poli(glicole etilenico)-alfa metacrilato (PEGαMA) è stata adattata da Hewawasam et al . ed eseguita in condizioni di assenza di umidità9.

  1. Pesare i reagenti.
    NOTA: Ad esempio, pesare 5 g di ossidrile PEG a 8 bracci da 10 g e 10 kg/mol e 0,38 g di idruro di sodio (NaH) (vedere la tabella dei materiali).
  2. Aggiungere una barra di agitazione al p.......

Representative Results

Questo protocollo descrive come biostampare in 3D idrogel fototabili all'interno di un bagno di supporto per creare costrutti in grado di irrigidirsi dinamici e temporali per studiare l'attivazione dei fibroblasti in geometrie che imitano i tessuti umani. In primo luogo, il protocollo ha spiegato come sintetizzare PEGαMA, la spina dorsale di questo sistema polimerico fototabile. Le misurazioni della spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) hanno mostrato una funzionalizzazione riuscita del PEGαMA al 96,5% (<.......

Discussion

Le reazioni di polimerizzazione a doppio stadio in risposta all'esposizione controllata alla luce possono irrigidire i biomateriali con controllo spaziale e temporale. Diversi studi hanno sfruttato questa tecnica per valutare le interazioni cellula-matrice in varie piattaforme 5,8,9,10,11,21,22,23.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Adam Feinberg (Carnegie Mellon University) e coloro che hanno ospitato il 3D Bioprinting Open-Source Workshop. Queste persone hanno reso possibile l'apprendimento delle tecniche di bioprinting FRESH e la costruzione della biostampante 3D utilizzata per questi studi. Inoltre, gli autori vorrebbero riconoscere Biorender.com, che è stato utilizzato per produrre figure in questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da più gruppi o fonti di finanziamento, tra cui la Rose Community Foundation (DDH e CMM), un Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award (DDH e CMM), la National Science Foundation nell'ambito dell'Award 1....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AccuMax Radiometer/Photometer KitSpectronics CorporationXPR-3000To measure light intensity, used for photostiffening
Acetic Acid Fisher ScientificBP2401-500Used during PEGaMA synthesis
AcetoneFisher ScientificA184Used with the cryosections
ActinGreen 488 ReadyProbesFisher ScientificR37110Used for staining
Aluminum FoilReynoldsF28028
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF)Sigma-Aldrich401757-1LUsed during PEGaMA synthesis
Argon Compressed GasAirgasAR R300Used during PEGaMA synthesis
8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH)JenKem Technology8ARM-PEG-10KUsed during PEGaMA synthesis
365 nm Bandpass FilterEdmund Optics65-191Used for photostiffening
Bovine Serum Albumin (BSA)Fisher ScientificBP9700-100Used during staining process
Buchner FunnelQuark GlassQFN-8-14Used during PEGaMA synthesis
Calcein AMInvitrogen65-0853-39Used during staining process
Celite 545 (Filtration Aid)EMD MilliporeCX0574-1Used during PEGaMA synthesis
Charged Microscope SlidesGlobe Scientific1358W
Chloroform-dSigma-Aldrich151823-10X0.75MLUsed to characterize PEGaMA
Click-iT Plus EdU Cell Proliferation KitInvitrogenC10637Used for staining
50 mL Conical TubesCELLTREAT667050B
Cryogenic Safety KitCole-ParmerEW-25000-85
CryostatLeicaCM 1850-3-1
Dialysis TubingRepligen132105
4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542-1MGUsed for staining
Diethyl EtherFisher ScientificE1384Used during PEGaMA synthesis
1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich10197777001Bioink component
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)CytivaSH30271.FS
Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA)Ambeed Inc.A918087-25gUsed during PEGaMA synthesis
Filter PaperWhatman1001-090Used during PEGaMA synthesis
Freezone 2.5L Freeze Dry SystemLabconcoLA-2.5LRLyophilizer
Fusion 360AutodeskN/ASoftware download
2.5 mL Gastight SyringeHamilton81420Used for bioprinting
15 Gauge 1.5" IT Series TipJensen GlobalJG15-1.5XUsed for bioprinting
30 Gauge 0.5" HP Series TipJensen GlobalJG30-0.5HPXUsed for bioprinting
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 AntibodyFisher ScientificA21422Used for staining
GlycineFisher ScientificC2H5NO2Used during staining process
HemocytometerFisher Scientific1461
HoechstThermo Scientific62249Used during staining process
Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs)AcceGenABC-TC3773 From a 2-year-old male patient
Hydrochloric Acid (HCl)Fisher ScientificA144-500Used to pH adjust solutions
ImageJNational Institutes of Health (NIH)N/AFree software download
ImmEdge® PenVector LaboratoriesH-4000Used during staining process
IncubatorVWRVWR51014991
LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry)Advanced Biomatrix5244-10GMUsed for bioprinting
Light MicroscopeOlympusCKX53Inverted light microscope
Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP)Sigma-Aldrich900889-5GPhotoinitiator used for photostiffening
Liquid NitrogenN/AN/A
LulzBot Mini 2 LulzBotN/ABioprinter adapted
Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B Polysciences Inc.669775-30-8
2-MethylbutaneSigma-AldrichM32631-4L
Microman Capillary Pistons CP1000VWR76178-166Positive displacement pipette tips
MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK)GL BiochemN/ABioink component
Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal AntibodyFisher ScientificMA5-11547Used for staining
OmniCure Series 2000 Lumen DynamicsS2000-XLAUV light source used for photostiffening
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences15710Used to fix samples
pH MeterMettler Toledo FP20 
pH StripsCytiva10362010
Phosphate Buffered Saline (PBS)Hyclone Laboratories, Inc.Cytiva SH30256.FS
Pipette SetFisher Scientific14-388-100
10 µL Pipette TipsUSA Scientific1120-3710
20 µL Pipette TipsUSA Scientific1183-1510
200 µL Pipette TipsUSA Scientific1111-0700
1000 µL Pipette TipsUSA Scientific1111-2721
Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA)N/AN/ARefer to manuscript for synthesis steps
Poly(Ethylene Oxide) (PEO)Sigma-Aldrich372773-250GBioink component
Positive Displacement PipetteFisher ScientificFD10004G100-1000 µL
Potassium Hydroxide (KOH)Sigma-Aldrich221473-500GUsed to pH adjust solutions
ProLong Gold Antifade ReagentInvitrogenP36930Used during staining process
PronterfaceAll3DPN/ASoftware download
Propidium IodideSigma-AldrichP4864-10MLUsed for staining
RGD Peptide (CGRGDS)GL BiochemN/ABioink component
RockerVWR10127-876
Rotary Evaporator Thomas Scientific11100V2022Used during PEGaMA synthesis
Rubber BandStaples808659
Schlenk Flask Kemtech AmericaF902450Used during PEGaMA synthesis
Slic3rSlic3rN/ASoftware download
Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKitLonzaCC-3182Kit contains CC-3181 and CC-4149 components
Sodium Hydride Sigma-Aldrich223441-50GUsed during PEGaMA synthesis
Sorvall ST 40R CentrifugeFisher Scientific75-004-525
Stir BarVWR58948-091
Syringe FilterVWR28145-483Used to sterile filter solutions
T-75 Tissue-Cultured Treated FlaskVWR82050-856Used for cell culture work
Tissue-Tek CyromoldSakura4557
Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT)Sakura4583
Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP)Sigma-AldrichC4706-2G
Triton X-100Fisher BioreagentsC34H622O11Used during staining process
Trypan BlueSigma-AldrichT8154-20MLUsed for cell culture work
0.05% Trypsin-EDTAGibco25-300-062Used for cell culture work
Tween 20Fisher BioreagentsC58H114O26Used during staining process
Upright MicroscopeOlympusBX63FFluorescent microscope capabilities
Water BathPolyScienceWBE20A11B
24-Well Tissue Culture PlatesCorning3527

References

  1. Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217 (2022).
  2. Lin, N. Y. C., et al.

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