A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Este artigo descreve como bioimprimir hidrogéis fototáveis em 3D para estudar o enrijecimento da matriz extracelular e a ativação de fibroblastos.
Os hidrogéis fotosajustáveis podem transformar-se espacial e temporalmente em resposta à exposição à luz. A incorporação desses tipos de biomateriais em plataformas de cultura celular e o desencadeamento dinâmico de mudanças, como o aumento da rigidez microambiental, permite aos pesquisadores modelar as mudanças na matriz extracelular (MEC) que ocorrem durante a progressão da doença fibrótica. Neste trabalho, é apresentado um método para bioimpressão 3D de um biomaterial hidrogel fototável capaz de duas reações sequenciais de polimerização dentro de um banho suporte de gelatina. A técnica de bioimpressão Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) foi adaptada ajustando-se o pH do banho de suporte para facilitar uma reação de adição de Michael. Primeiro, a biotinta contendo poli(etilenoglicol)-alfa metacrilato (PEGαMA) foi reagida fora da estequiometria com um reticulante degradável por células para formar hidrogéis moles. Esses hidrogéis moles foram posteriormente expostos ao fotoinibidor e à luz para induzir a homopolimerização dos grupos não reagidos e enrijecer o hidrogel. Este protocolo abrange síntese de hidrogel, bioimpressão 3D, fotoenrijecimento e caracterizações de desfechos para avaliar a ativação de fibroblastos em estruturas 3D. O método aqui apresentado permite aos pesquisadores bioimprimir em 3D uma variedade de materiais que sofrem reações de polimerização catalisadas por pH e pode ser implementado para projetar vários modelos de homeostase, doença e reparo tecidual.
A bioimpressão 3D é uma tecnologia transformadora que permite aos pesquisadores depositar com precisão células e biomateriais em volumes 3D e recriar a complexa estrutura hierárquica dos tecidos biológicos. Na última década, avanços na bioimpressão 3D criaram tecidos cardíacos humanos batidos1, modelos funcionais de tecidos renais2, modelos de trocas gasosas dentro do pulmão3 e modelos tumorais para pesquisa de câncer4. A invenção de técnicas de bioimpressão 3D incorporadas, como a bioimpressão Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH), tornou possível rep....
1. Síntese e caracterização de PEGαMA
NOTA: A síntese de poli(etilenoglicol)-alfametacrilato (PEGαMA) foi adaptada de Hewawasam e col. e realizada em condições livres de umidade9.
Este protocolo descreve como bioimprimir hidrogéis fototáveis em 3D dentro de um banho de suporte para criar construções capazes de enrijecimento dinâmico e temporal para estudar a ativação de fibroblastos em geometrias que mimetizam tecidos humanos. Primeiro, o protocolo explicou como sintetizar PEGαMA, a espinha dorsal desse sistema polimérico fotosintonizável. Medidas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) mostraram sucesso na funcionalização do PEGαMA em 96,5% (Fi.......
Reações de polimerização em duplo estágio em resposta à exposição controlada à luz podem enrijecer biomateriais com controle espacial e temporal. Vários estudos têm utilizado essa técnica para avaliar interações célula-matriz em diversas plataformas5,8,9,10,11,21,22,23.
Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Adam Feinberg (Carnegie Mellon University) e àqueles que organizaram o 3D Bioprinting Open-Source Workshop. Esses indivíduos possibilitaram o aprendizado das técnicas de bioimpressão FRESH e a construção da bioimpressora 3D utilizada para esses estudos. Além disso, os autores gostariam de agradecer Biorender.com, que foi usado para produzir figuras neste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por vários grupos ou fontes de financiamento, incluindo a Rose Community Foundation (DDH e CMM), um Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award (DDH e CMM), a National Science Foundation sob Award 1941401 (CMM), o Departamento do Exé....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | To measure light intensity, used for photostiffening |
Acetic Acid | Fisher Scientific | BP2401-500 | Used during PEGaMA synthesis |
Acetone | Fisher Scientific | A184 | Used with the cryosections |
ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Used for staining |
Aluminum Foil | Reynolds | F28028 | |
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Used during PEGaMA synthesis |
Argon Compressed Gas | Airgas | AR R300 | Used during PEGaMA synthesis |
8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Used during PEGaMA synthesis |
365 nm Bandpass Filter | Edmund Optics | 65-191 | Used for photostiffening |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Used during staining process |
Buchner Funnel | Quark Glass | QFN-8-14 | Used during PEGaMA synthesis |
Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Used during staining process |
Celite 545 (Filtration Aid) | EMD Millipore | CX0574-1 | Used during PEGaMA synthesis |
Charged Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Used to characterize PEGaMA |
Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Used for staining |
50 mL Conical Tubes | CELLTREAT | 667050B | |
Cryogenic Safety Kit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
Dialysis Tubing | Repligen | 132105 | |
4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Used for staining |
Diethyl Ether | Fisher Scientific | E1384 | Used during PEGaMA synthesis |
1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA) | Ambeed Inc. | A918087-25g | Used during PEGaMA synthesis |
Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Used during PEGaMA synthesis |
Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyophilizer |
Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
2.5 mL Gastight Syringe | Hamilton | 81420 | Used for bioprinting |
15 Gauge 1.5" IT Series Tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Used for bioprinting |
30 Gauge 0.5" HP Series Tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Used for bioprinting |
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 Antibody | Fisher Scientific | A21422 | Used for staining |
Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Used during staining process |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Used during staining process |
Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | From a 2-year-old male patient |
Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Used to pH adjust solutions |
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Free software download |
ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Used during staining process |
Incubator | VWR | VWR51014991 | |
LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Used for bioprinting |
Light Microscope | Olympus | CKX53 | Inverted light microscope |
Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Photoinitiator used for photostiffening |
Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter adapted |
Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
2-Methylbutane | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
Microman Capillary Pistons CP1000 | VWR | 76178-166 | Positive displacement pipette tips |
MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal Antibody | Fisher Scientific | MA5-11547 | Used for staining |
OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV light source used for photostiffening |
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Used to fix samples |
pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
Pipette Set | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
10 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1120-3710 | |
20 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1183-1510 | |
200 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-0700 | |
1000 µL Pipette Tips | USA Scientific | 1111-2721 | |
Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA) | N/A | N/A | Refer to manuscript for synthesis steps |
Poly(Ethylene Oxide) (PEO) | Sigma-Aldrich | 372773-250G | Bioink component |
Positive Displacement Pipette | Fisher Scientific | FD10004G | 100-1000 µL |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473-500G | Used to pH adjust solutions |
ProLong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | Used during staining process |
Pronterface | All3DP | N/A | Software download |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | Used for staining |
RGD Peptide (CGRGDS) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
Rocker | VWR | 10127-876 | |
Rotary Evaporator | Thomas Scientific | 11100V2022 | Used during PEGaMA synthesis |
Rubber Band | Staples | 808659 | |
Schlenk Flask | Kemtech America | F902450 | Used during PEGaMA synthesis |
Slic3r | Slic3r | N/A | Software download |
Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKit | Lonza | CC-3182 | Kit contains CC-3181 and CC-4149 components |
Sodium Hydride | Sigma-Aldrich | 223441-50G | Used during PEGaMA synthesis |
Sorvall ST 40R Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-525 | |
Stir Bar | VWR | 58948-091 | |
Syringe Filter | VWR | 28145-483 | Used to sterile filter solutions |
T-75 Tissue-Cultured Treated Flask | VWR | 82050-856 | Used for cell culture work |
Tissue-Tek Cyromold | Sakura | 4557 | |
Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT) | Sakura | 4583 | |
Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
Triton X-100 | Fisher Bioreagents | C34H622O11 | Used during staining process |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | Used for cell culture work |
0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-062 | Used for cell culture work |
Tween 20 | Fisher Bioreagents | C58H114O26 | Used during staining process |
Upright Microscope | Olympus | BX63F | Fluorescent microscope capabilities |
Water Bath | PolyScience | WBE20A11B | |
24-Well Tissue Culture Plates | Corning | 3527 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved