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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este artigo descreve como bioimprimir hidrogéis fototáveis em 3D para estudar o enrijecimento da matriz extracelular e a ativação de fibroblastos.

Abstract

Os hidrogéis fotosajustáveis podem transformar-se espacial e temporalmente em resposta à exposição à luz. A incorporação desses tipos de biomateriais em plataformas de cultura celular e o desencadeamento dinâmico de mudanças, como o aumento da rigidez microambiental, permite aos pesquisadores modelar as mudanças na matriz extracelular (MEC) que ocorrem durante a progressão da doença fibrótica. Neste trabalho, é apresentado um método para bioimpressão 3D de um biomaterial hidrogel fototável capaz de duas reações sequenciais de polimerização dentro de um banho suporte de gelatina. A técnica de bioimpressão Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) foi adaptada ajustando-se o pH do banho de suporte para facilitar uma reação de adição de Michael. Primeiro, a biotinta contendo poli(etilenoglicol)-alfa metacrilato (PEGαMA) foi reagida fora da estequiometria com um reticulante degradável por células para formar hidrogéis moles. Esses hidrogéis moles foram posteriormente expostos ao fotoinibidor e à luz para induzir a homopolimerização dos grupos não reagidos e enrijecer o hidrogel. Este protocolo abrange síntese de hidrogel, bioimpressão 3D, fotoenrijecimento e caracterizações de desfechos para avaliar a ativação de fibroblastos em estruturas 3D. O método aqui apresentado permite aos pesquisadores bioimprimir em 3D uma variedade de materiais que sofrem reações de polimerização catalisadas por pH e pode ser implementado para projetar vários modelos de homeostase, doença e reparo tecidual.

Introduction

A bioimpressão 3D é uma tecnologia transformadora que permite aos pesquisadores depositar com precisão células e biomateriais em volumes 3D e recriar a complexa estrutura hierárquica dos tecidos biológicos. Na última década, avanços na bioimpressão 3D criaram tecidos cardíacos humanos batidos1, modelos funcionais de tecidos renais2, modelos de trocas gasosas dentro do pulmão3 e modelos tumorais para pesquisa de câncer4. A invenção de técnicas de bioimpressão 3D incorporadas, como a bioimpressão Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (FRESH), tornou possível rep....

Protocol

1. Síntese e caracterização de PEGαMA

NOTA: A síntese de poli(etilenoglicol)-alfametacrilato (PEGαMA) foi adaptada de Hewawasam e col. e realizada em condições livres de umidade9.

  1. Pese os reagentes.
    NOTA: Por exemplo, pesar 5 g de PEG-hidroxila de 8 braços de 10 kg/mol (PEG-OH) e 0,38 g de hidreto de sódio (NaH) (ver Tabela de Materiais).
  2. Adicionar uma barra de agitação a 250 ml de balão de S.......

Representative Results

Este protocolo descreve como bioimprimir hidrogéis fototáveis em 3D dentro de um banho de suporte para criar construções capazes de enrijecimento dinâmico e temporal para estudar a ativação de fibroblastos em geometrias que mimetizam tecidos humanos. Primeiro, o protocolo explicou como sintetizar PEGαMA, a espinha dorsal desse sistema polimérico fotosintonizável. Medidas de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) mostraram sucesso na funcionalização do PEGαMA em 96,5% (Fi.......

Discussion

Reações de polimerização em duplo estágio em resposta à exposição controlada à luz podem enrijecer biomateriais com controle espacial e temporal. Vários estudos têm utilizado essa técnica para avaliar interações célula-matriz em diversas plataformas5,8,9,10,11,21,22,23.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Adam Feinberg (Carnegie Mellon University) e àqueles que organizaram o 3D Bioprinting Open-Source Workshop. Esses indivíduos possibilitaram o aprendizado das técnicas de bioimpressão FRESH e a construção da bioimpressora 3D utilizada para esses estudos. Além disso, os autores gostariam de agradecer Biorender.com, que foi usado para produzir figuras neste manuscrito. Este trabalho foi apoiado por vários grupos ou fontes de financiamento, incluindo a Rose Community Foundation (DDH e CMM), um Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award (DDH e CMM), a National Science Foundation sob Award 1941401 (CMM), o Departamento do Exé....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AccuMax Radiometer/Photometer KitSpectronics CorporationXPR-3000To measure light intensity, used for photostiffening
Acetic Acid Fisher ScientificBP2401-500Used during PEGaMA synthesis
AcetoneFisher ScientificA184Used with the cryosections
ActinGreen 488 ReadyProbesFisher ScientificR37110Used for staining
Aluminum FoilReynoldsF28028
Anhydrous Tetrahydrofuran (THF)Sigma-Aldrich401757-1LUsed during PEGaMA synthesis
Argon Compressed GasAirgasAR R300Used during PEGaMA synthesis
8 Arm Poly(ethylene glycol)-hydroxyl (PEG-OH)JenKem Technology8ARM-PEG-10KUsed during PEGaMA synthesis
365 nm Bandpass FilterEdmund Optics65-191Used for photostiffening
Bovine Serum Albumin (BSA)Fisher ScientificBP9700-100Used during staining process
Buchner FunnelQuark GlassQFN-8-14Used during PEGaMA synthesis
Calcein AMInvitrogen65-0853-39Used during staining process
Celite 545 (Filtration Aid)EMD MilliporeCX0574-1Used during PEGaMA synthesis
Charged Microscope SlidesGlobe Scientific1358W
Chloroform-dSigma-Aldrich151823-10X0.75MLUsed to characterize PEGaMA
Click-iT Plus EdU Cell Proliferation KitInvitrogenC10637Used for staining
50 mL Conical TubesCELLTREAT667050B
Cryogenic Safety KitCole-ParmerEW-25000-85
CryostatLeicaCM 1850-3-1
Dialysis TubingRepligen132105
4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI)Sigma-AldrichD9542-1MGUsed for staining
Diethyl EtherFisher ScientificE1384Used during PEGaMA synthesis
1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich10197777001Bioink component
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)CytivaSH30271.FS
Ethyl 2-(Bromomethyl)Acrylate (EBrMA)Ambeed Inc.A918087-25gUsed during PEGaMA synthesis
Filter PaperWhatman1001-090Used during PEGaMA synthesis
Freezone 2.5L Freeze Dry SystemLabconcoLA-2.5LRLyophilizer
Fusion 360AutodeskN/ASoftware download
2.5 mL Gastight SyringeHamilton81420Used for bioprinting
15 Gauge 1.5" IT Series TipJensen GlobalJG15-1.5XUsed for bioprinting
30 Gauge 0.5" HP Series TipJensen GlobalJG30-0.5HPXUsed for bioprinting
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 555 AntibodyFisher ScientificA21422Used for staining
GlycineFisher ScientificC2H5NO2Used during staining process
HemocytometerFisher Scientific1461
HoechstThermo Scientific62249Used during staining process
Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs)AcceGenABC-TC3773 From a 2-year-old male patient
Hydrochloric Acid (HCl)Fisher ScientificA144-500Used to pH adjust solutions
ImageJNational Institutes of Health (NIH)N/AFree software download
ImmEdge® PenVector LaboratoriesH-4000Used during staining process
IncubatorVWRVWR51014991
LifeSupport Gelatin Microparticle Slurry (Gelatin Slurry)Advanced Biomatrix5244-10GMUsed for bioprinting
Light MicroscopeOlympusCKX53Inverted light microscope
Lithium Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinate (LAP)Sigma-Aldrich900889-5GPhotoinitiator used for photostiffening
Liquid NitrogenN/AN/A
LulzBot Mini 2 LulzBotN/ABioprinter adapted
Methacryloxyethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B Polysciences Inc.669775-30-8
2-MethylbutaneSigma-AldrichM32631-4L
Microman Capillary Pistons CP1000VWR76178-166Positive displacement pipette tips
MMP2 Degradable Crosslinker (KCGGPQGIWGQGCK)GL BiochemN/ABioink component
Mouse Anti-Human αSMA Monoclonal AntibodyFisher ScientificMA5-11547Used for staining
OmniCure Series 2000 Lumen DynamicsS2000-XLAUV light source used for photostiffening
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences15710Used to fix samples
pH MeterMettler Toledo FP20 
pH StripsCytiva10362010
Phosphate Buffered Saline (PBS)Hyclone Laboratories, Inc.Cytiva SH30256.FS
Pipette SetFisher Scientific14-388-100
10 µL Pipette TipsUSA Scientific1120-3710
20 µL Pipette TipsUSA Scientific1183-1510
200 µL Pipette TipsUSA Scientific1111-0700
1000 µL Pipette TipsUSA Scientific1111-2721
Poly(Ethylene Glycol)-Alpha Methacrylate (PEGαMA)N/AN/ARefer to manuscript for synthesis steps
Poly(Ethylene Oxide) (PEO)Sigma-Aldrich372773-250GBioink component
Positive Displacement PipetteFisher ScientificFD10004G100-1000 µL
Potassium Hydroxide (KOH)Sigma-Aldrich221473-500GUsed to pH adjust solutions
ProLong Gold Antifade ReagentInvitrogenP36930Used during staining process
PronterfaceAll3DPN/ASoftware download
Propidium IodideSigma-AldrichP4864-10MLUsed for staining
RGD Peptide (CGRGDS)GL BiochemN/ABioink component
RockerVWR10127-876
Rotary Evaporator Thomas Scientific11100V2022Used during PEGaMA synthesis
Rubber BandStaples808659
Schlenk Flask Kemtech AmericaF902450Used during PEGaMA synthesis
Slic3rSlic3rN/ASoftware download
Smooth Muscle Cell Growth Medium-2 (SmGM-2) BulletKitLonzaCC-3182Kit contains CC-3181 and CC-4149 components
Sodium Hydride Sigma-Aldrich223441-50GUsed during PEGaMA synthesis
Sorvall ST 40R CentrifugeFisher Scientific75-004-525
Stir BarVWR58948-091
Syringe FilterVWR28145-483Used to sterile filter solutions
T-75 Tissue-Cultured Treated FlaskVWR82050-856Used for cell culture work
Tissue-Tek CyromoldSakura4557
Tissue-Tek O.C.T Compound (OCT)Sakura4583
Tris(2-Carboxyethyl) Phosphine (TCEP)Sigma-AldrichC4706-2G
Triton X-100Fisher BioreagentsC34H622O11Used during staining process
Trypan BlueSigma-AldrichT8154-20MLUsed for cell culture work
0.05% Trypsin-EDTAGibco25-300-062Used for cell culture work
Tween 20Fisher BioreagentsC58H114O26Used during staining process
Upright MicroscopeOlympusBX63FFluorescent microscope capabilities
Water BathPolyScienceWBE20A11B
24-Well Tissue Culture PlatesCorning3527

References

  1. Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217 (2022).
  2. Lin, N. Y. C., et al.

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