Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

התכנון הניסיוני המוצג כאן מספק מודל רבייה שימושי למחקרים של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן במהלך גרורות בלוטות הלימפה (LN), אשר אינו כולל את ההפרעה של תאי CD8+ T עוברי אורח.

Abstract

תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן הגידול מבלוטות לימפה מתנקזות מקבלים חשיבות מצטברת בהגברת התגובה החיסונית נגד הגידול במהלך הגידול. עם זאת, במקרים רבים, תאים סרטניים יוצרים מוקדים גרורתיים בבלוטות הלימפה לפני גרורות נוספות לאיברים מרוחקים. באיזו מידה התגובות המקומיות והשיטתיות של תאי CD8+ T הושפעו מגרורות LN נותרה מעורפלת. לשם כך, הקמנו מודל גרורות LN מורין בשילוב עם קו תאי מלנומה B16F10-GP המבטא את הניאואנטיגן החלופי הנגזר מנגיף כוריאומנינגיטיס לימפוציטית (LCMV), גליקופרוטאין (GP) ועכברים טרנסגניים P14 בעלי קולטני תאי T (TCRs) ספציפיים לפפטיד GP33-41 שמקורו ב-GP המוצג על ידי מולקולת קומפלקס היסטותאימות גדולה (MHC) מסוג I H-2Db. פרוטוקול זה מאפשר לחקור תגובות ספציפיות לתאי CD8+ T של אנטיגן במהלך גרורות LN. בפרוטוקול זה, עכברי C57BL/6J הושתלו תת עורית עם תאי B16F10-GP, ולאחר מכן העברה מאומצת עם תאי P14 נאיביים. כאשר הגידול התת עורי גדל לקוטר של כ-5 מ"מ, הגידול הראשוני נכרת, ותאי B16F10-GP הוזרקו ישירות לבלוטת הלימפה המנקזת את הגידול (TdLN). לאחר מכן, הדינמיקה של תאי CD8+ T נוטרה במהלך תהליך גרורות LN. באופן קולקטיבי, מודל זה סיפק גישה לחקור במדויק את התגובה החיסונית הספציפית לאנטיגן CD8+ T של תאי T במהלך גרורות LN.

Introduction

אימונותרפיה לסרטן, במיוחד חסימת נקודות בקרה חיסוניות (ICB), חוללה מהפכה בטיפול בסרטן1. ICB חוסם את קולטני החיסון המעכבים (כגון PD-1, Tim-3, LAG-3 ו- TIGIT), אשר באים לידי ביטוי גבוה בתאי CD8+ T מותשים במיקרו-סביבה של הגידול (TME), מה שמוביל להתחדשות של תאי CD8+ T מותשים2. בהתחשב בהטרוגניות של תאי CD8+ T מותשים, עדויות מצטברות גילו כי תאי CD8+ T ספציפיים לגידול שמקורם בפריפריה, כולל ניקוז בלוטת הלימפה (dLN), אך לא ב- TME, מתווכים את היעילות של ICB 3,4,5,6,7,8.

Protocol

עכברי C57BL/6J (המכונים עכברי B6) ועכברי P14 טרנסגניים נאיביים 9,27 היו בני 6-10 שבועות במשקל 18-22 גרם. הן זכר והן נקבה נכללו ללא אקראיות או סינוור. כל המחקרים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה החקלאית של צ'ינגדאו.

Representative Results

התרשים הסכמטי של תכנון ניסויי זה מוצג באיור 1A. סך של 5 x 105 תאי B16F10-GP ב 100 μL של PBS הושתלו תת עורית (s.c.) באזור המפשעה הדו-צדדי של עכברי CD45.2 C57BL/6J. לאחר 7 ימים, עכברים נושאי גידול אלה הוזרקו תוך צפקית (כלומר) עם 4 מ"ג CTX, ולאחר מכן העברה מאומצת של 5 x 105 CD45.1 + P14 תאים באמצעו?.......

Discussion

במהלך הגידול, תאים מציגי אנטיגן (APCs) בולעים אנטיגנים סרטניים ונודדים ל- TdLN שם הם ראשונים תאי CD8+ T. לאחר הפריימינג וההפעלה, תאי T CD8+ עוזבים את ה- TdLN וחודרים לגידול כדי להרוג תאי גידול10. באמצעות כריתת TdLN ומתן FTY720 אשר חוסמים את יציאת תאי החיסון מאיברי הלימפה, מספר מחקרים ה.......

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע לחוקרים צעירים מצטיינים של סין (מס '82122028 ל- LX), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '82173094 ל- LX), הקרן למדעי הטבע של צ'ונג צ'ינג (מס '2023NSCQ-BHX0087 ל- SW).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL centrifuge tubeKIRGENKG2211
100 U insulin syringeBD Biosciences 320310
15 mL conical tube BEAVER 43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma T48402-25G 
2-Methyl-2-butanolSigma240486-100ML 
70 μm nylon cell strainerBD Falcon 352350
APC anti-mouse CD45.1 BioLegend 110714Clone:A20 
B16-GP cell lineBeijing Biocytogen Co.Ltd, ChinaCustom
BSA-V (bovine serum albumin) Biossbs-0292P
cell culture dishBEAVER 43701/43702/43703 
centrifugeEppendorf5810R-A462/5424R 
cyclophosphamideSigma C0768-25G 
Cyclophosphamide (CTX)SigmaPHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco C11995500BT 
EDTASigmaEDS-500g 
FACS tubesBD Falcon352052
fetal bovine serum Gibco10270-106
flow cytometerBDFACSCanto II
hemocytometerPorLab ScientificHM330
isofluraneRWD life science R510-22-16 
KHCO3 Sangon Biotech A501195-0500 
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation Life Technologies L10199 
needle carrier RWD Life Science F31034-14 
NH4Cl Sangon BiotechA501569-0500 
paraformaldehydeBeyotimeP0099-500ml 
PE anti-mouse TCR Vα2BioLegend127808Clone:B20.1 
Pen Strep Glutamine (100x)Gibco10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a BioLegend100734Clone:53-6.7
RPMI-1640SigmaR8758-500ML
sodium azideSigmaS2002 
surgical forcepsRWD Life Science F12005-10
surgical scissorsRWD Life Science S12003-09 
suture threadRWD Life ScienceF34004-30 
trypsin-EDTASigmaT4049-100ml

References

  1. Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
  2. Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N.

Explore More Articles

JoVE203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved