A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
התכנון הניסיוני המוצג כאן מספק מודל רבייה שימושי למחקרים של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן במהלך גרורות בלוטות הלימפה (LN), אשר אינו כולל את ההפרעה של תאי CD8+ T עוברי אורח.
תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן הגידול מבלוטות לימפה מתנקזות מקבלים חשיבות מצטברת בהגברת התגובה החיסונית נגד הגידול במהלך הגידול. עם זאת, במקרים רבים, תאים סרטניים יוצרים מוקדים גרורתיים בבלוטות הלימפה לפני גרורות נוספות לאיברים מרוחקים. באיזו מידה התגובות המקומיות והשיטתיות של תאי CD8+ T הושפעו מגרורות LN נותרה מעורפלת. לשם כך, הקמנו מודל גרורות LN מורין בשילוב עם קו תאי מלנומה B16F10-GP המבטא את הניאואנטיגן החלופי הנגזר מנגיף כוריאומנינגיטיס לימפוציטית (LCMV), גליקופרוטאין (GP) ועכברים טרנסגניים P14 בעלי קולטני תאי T (TCRs) ספציפיים לפפטיד GP33-41 שמקורו ב-GP המוצג על ידי מולקולת קומפלקס היסטותאימות גדולה (MHC) מסוג I H-2Db. פרוטוקול זה מאפשר לחקור תגובות ספציפיות לתאי CD8+ T של אנטיגן במהלך גרורות LN. בפרוטוקול זה, עכברי C57BL/6J הושתלו תת עורית עם תאי B16F10-GP, ולאחר מכן העברה מאומצת עם תאי P14 נאיביים. כאשר הגידול התת עורי גדל לקוטר של כ-5 מ"מ, הגידול הראשוני נכרת, ותאי B16F10-GP הוזרקו ישירות לבלוטת הלימפה המנקזת את הגידול (TdLN). לאחר מכן, הדינמיקה של תאי CD8+ T נוטרה במהלך תהליך גרורות LN. באופן קולקטיבי, מודל זה סיפק גישה לחקור במדויק את התגובה החיסונית הספציפית לאנטיגן CD8+ T של תאי T במהלך גרורות LN.
אימונותרפיה לסרטן, במיוחד חסימת נקודות בקרה חיסוניות (ICB), חוללה מהפכה בטיפול בסרטן1. ICB חוסם את קולטני החיסון המעכבים (כגון PD-1, Tim-3, LAG-3 ו- TIGIT), אשר באים לידי ביטוי גבוה בתאי CD8+ T מותשים במיקרו-סביבה של הגידול (TME), מה שמוביל להתחדשות של תאי CD8+ T מותשים2. בהתחשב בהטרוגניות של תאי CD8+ T מותשים, עדויות מצטברות גילו כי תאי CD8+ T ספציפיים לגידול שמקורם בפריפריה, כולל ניקוז בלוטת הלימפה (dLN), אך לא ב- TME, מתווכים את היעילות של ICB 3,4,5,6,7,8.
עכברי C57BL/6J (המכונים עכברי B6) ועכברי P14 טרנסגניים נאיביים 9,27 היו בני 6-10 שבועות במשקל 18-22 גרם. הן זכר והן נקבה נכללו ללא אקראיות או סינוור. כל המחקרים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה החקלאית של צ'ינגדאו.
התרשים הסכמטי של תכנון ניסויי זה מוצג באיור 1A. סך של 5 x 105 תאי B16F10-GP ב 100 μL של PBS הושתלו תת עורית (s.c.) באזור המפשעה הדו-צדדי של עכברי CD45.2 C57BL/6J. לאחר 7 ימים, עכברים נושאי גידול אלה הוזרקו תוך צפקית (כלומר) עם 4 מ"ג CTX, ולאחר מכן העברה מאומצת של 5 x 105 CD45.1 + P14 תאים באמצעו?.......
במהלך הגידול, תאים מציגי אנטיגן (APCs) בולעים אנטיגנים סרטניים ונודדים ל- TdLN שם הם ראשונים תאי CD8+ T. לאחר הפריימינג וההפעלה, תאי T CD8+ עוזבים את ה- TdLN וחודרים לגידול כדי להרוג תאי גידול10. באמצעות כריתת TdLN ומתן FTY720 אשר חוסמים את יציאת תאי החיסון מאיברי הלימפה, מספר מחקרים ה.......
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע לחוקרים צעירים מצטיינים של סין (מס '82122028 ל- LX), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '82173094 ל- LX), הקרן למדעי הטבע של צ'ונג צ'ינג (מס '2023NSCQ-BHX0087 ל- SW).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
EDTA | Sigma | EDS-500g | |
FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
sodium azide | Sigma | S2002 | |
surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved